骨髓間充質干細胞體外向腸神經元的誘導分化及其機制的初步探討.pdf

1、先天性巨結腸(Hirschsprung's disease，HD)是小兒消化道常見畸形，發(fā)病率為1/2000～1/5000，其疾病的發(fā)生目前一致認為是由于多種原因使胚胎期神經嵴細胞在消化道移行受阻，直腸、結腸甚至小腸腸壁神經節(jié)細胞缺如，病變腸管痙攣收縮，腸內容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴張形成巨結腸。迄今，手術仍然是最有效的治療手段，雖然，手術方式的不斷改進，微創(chuàng)手術的日益進步，但術后并發(fā)癥仍困擾著患者和醫(yī)護工作者。而近年來研究的熱點之

2、一細胞移植有望成為治療HD又一有效并且安全的方法，本課題將研究如何獲得具有功能的細胞進行移植。
　　 骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)在體外容易分離、培養(yǎng)及純化，多向分化潛能是其最主要的生物學特征之一，現在關于BMSC向神經方向分化的研究報道較多，許多研究表明BMSC在體外一定條件下可分化為神經細胞，移植于損傷腦或脊髓治療神經系統疾病，這為BMSC治療腸神經系統疾病提供了理論依

3、據，并避免了神經干細胞、胚胎干細胞移植來源不足及倫理問題。目前BMSC向神經細胞分化的具體機制尚不清楚，可能與誘導劑的共同作用啟動了向神經細胞定向分化有關的基因表達或使其表達增強有關。較常見的是用β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及維甲酸等化學物質進行誘導，也有用某些生長因子進行誘導的。神經營養(yǎng)因子的作用也已受到重視，一方面，神經營養(yǎng)因子可在一定培養(yǎng)條件

4、下誘導BMSC向神經細胞分化；另一方面，神經營養(yǎng)因子具有神經保護和促進神經突起生長的作用，缺乏神經營養(yǎng)因子的支持可能導致神經細胞的凋亡發(fā)生。
　　 本實驗先從探討B(tài)MSC向神經細胞分化的條件，以及有關神經營養(yǎng)因子表達的變化，如膠質細胞源神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF，RET(rearranged during transfection)等開始，初步探

5、討了其分化的機制，其結果發(fā)現堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可促進BMSC向神經細胞分化，在向神經細胞分化的過程中，GDNF表達增強，并且RET基因也有表達，GDNF可能在BMSC向神經細胞分化過程中起到重要作用。在BMSC向腸神經元分化的可行性實驗研究中，將GDNF作為誘導因子與胎腸培養(yǎng)基共同作用，誘

6、導BMSC分化為腸神經元，誘導后的細胞，不僅表達神經元標志物神經特異性烯醇化酶(neural specific enolase，NSE)以及腸神經標志物一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nNOS)，而且還能分泌腸神經遞質腸道血管活性肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)，說明體外分化的腸神經元不僅具備形態(tài)學上的特征，而且具有一定程度的功能。為了提高BMSC向腸神經元的分化率，本實

7、驗還進行了GDNF基因轉入BMSC的研究，結果顯示，體外可成功構建表達GDNF的轉基因BMSC，在FGCM的誘導下可分化為具有腸神經元表型的細胞，并且誘導分化率高于外源性GDNF組。
　　 但關于誘導后的腸神經元是否具備正常腸神經元的功能，移植于無神經節(jié)段后能否改善腸段的功能，還有待下一步的在體實驗進一步研究。
　　 第一部分：大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定
　　 目的：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干

8、細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)，并進行純化和鑒定。
　　 方法：收集Sprague-Dawley(SD)大鼠的股骨骨髓，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基直接種植于培養(yǎng)瓶，反復傳代貼壁法純化細胞，流式細胞儀檢測CD90及CD45。
　　 結果：BMSC能在體外貼壁生長，經過反復貼壁，BMSC可融合生長，高表達BMSC標志物CD90(93.4%)，不表達造血干細胞標志物CD45。<

9、br>　　 結論：體外可成功培養(yǎng)BMSC，經過反復貼壁法可純化BMSC，可獲得高純度的細胞。
　　 第二部分：骨髓間充質干細胞體外向神經細胞的誘導分化
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向神經分化的條件，了解神經細胞標志物的表達情況及膠質細胞源神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDN

10、F)的表達變化。
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠BMSC，至少傳至第4代，進行誘導分化。以10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或/和10ng/ml表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)在含10%胎牛血清的DMEM中誘導，7d后觀察細胞形態(tài)的變化，免疫組化檢測膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic prot

11、ein，GFAP）及神經特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）的情況。RT-PCR檢測GDNF及其受體RET mRNA的變化。
　　 結果：誘導7天后，實驗組均可見GFAP及NSE的表達，而對照組為陰性。各實驗組比較，bFGF組及bFGF+EGF組表達的NSE高于EGF組，而EGF組表達GFAP更高。RT-PCR檢測示，BMSC向神經細胞誘導后，GDNF表達顯著增強，RET基因也開始表達，以bF

12、GF+EGF組最明顯。
　　 結論：bFGF及EGF可促進BMSC向神經細胞分化。在向神經細胞分化的過程中，能促進GDNF表達的增強，以及RET基因的表達，GDNF可能在BMSC向神經細胞分化過程中起到重要作用。
　　 第三部分：骨髓間充質干細胞體外兩種方法向腸神經元誘導分化及比較
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向腸神經分化的條件及可行性，

13、并比較兩種方法的分化效率。
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠BMSC，傳至第4代后，進行誘導分化。第一種方法：以10ng/ml膠質細胞源神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)及10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的稀釋胎腸培養(yǎng)基(fetal gut condition medium，FGCM)誘導7天，免疫組化的方法進行鑒定誘導細胞的神經

14、特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）及神經元一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）的表達。第二種方法：提取新生大鼠腸組織mRNA，用逆轉錄PCR方法擴增GDNF全長cDNA，構建其真核表達載體PIRES2-EGFP-GDNF，酶切及測序鑒定，然后轉染原代培養(yǎng)的大鼠BMSC

15、，熒光免疫細胞化學及細胞形態(tài)學檢測GDNF的表達，轉染后的細胞在稀釋的FGCM條件下誘導分化。同樣的方法檢測VIP，nNOS。
　　 結果：BMSC誘導7天后，兩組實驗組均可見NSE、VIP及nNOS的表達，而對照組為陰性。表達GDNF的BMSC被誘導分化的腸神經元NSE陽性，VIP及nNOS陽性率高于外源性GDNF誘導的細胞。
　　 結論：GDNF聯合FGCM可誘導BMSC分化為腸神經元。表達GDNF的BMSC分化為腸

16、神經元的效率更高。
　　 第四部分：骨髓間充質干細胞向腸神經元分化后神經營養(yǎng)因子表達的變化及其機制的初步探討
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向腸神經分化過程中膠質細胞源神經營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）及其受體RET以及c-kit基因表達的變化，并對其機制進行初步探討。<

17、br>　　 方法：同樣的方法誘導BMSC為腸神經元，免疫組化的方法進行鑒定誘導細胞的神經特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，nNOS）的表達。RT-PCR檢測GDNF、RET及 c-kit mRNA的變化，Western Blot方法檢測GDNF蛋白的表達情

18、況。
　　 結果：BMSC向腸神經元誘導后，免疫組化染色NSE，VIP及nNOS陽性，RT-PCR結果顯示，誘導前低表達GDNF以及不表達RET、C-kit,誘導后GDNF表達顯著增強，RET、c-kit基因表達，而且GDNF在蛋白水平上也有表達。
　　 結論：GDNF聯合FGCM可誘導BMSC分化為腸神經元，誘導后的細胞表達腸神經元標志物，其GDNF、RET及c-kit基因表達增強；GDNF-RET信號通路在誘導分化過