抗OX40單抗研制及抗CD47單抗聯(lián)合用藥探究.pdf

1、腫瘤免疫治療是目前單克隆抗體的一個(gè)主要發(fā)展方向。以PD1-PDL1通路為代表的免疫檢查點(diǎn)抗體在臨床上的巨大成功使更多的與免疫細(xì)胞激活相關(guān)靶點(diǎn)的抗體藥物的研發(fā)成為熱點(diǎn)。其中，OX40、CD47兩個(gè)免疫系統(tǒng)相關(guān)分子，被逐步驗(yàn)證可以作為有效的治療性抗體靶點(diǎn)。
　　OX40（又稱CD134、TNFRSF4、ACT35）是表達(dá)于活化的CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面的激活性受體。OX40信號(hào)可以激活下游的NF-κB、PI3K和PKB通路，這些

2、通路的持續(xù)激活最終能夠延長(zhǎng)T細(xì)胞的存活，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。OX40廣泛表達(dá)于慢性炎癥及腫瘤部位的T細(xì)胞上。其配體OX40L能夠促進(jìn)B細(xì)胞的活化及抗體產(chǎn)生。兩者能在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞之間進(jìn)行雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能。因此，研發(fā)抗OX40抗體對(duì)腫瘤治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　CD47（又稱整聯(lián)蛋白、卵巢癌標(biāo)志物）是表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面并作用于巨噬細(xì)胞及DC細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)分子，通過(guò)與巨噬細(xì)胞表面的SIRPα結(jié)合向其傳遞

3、“Don′t eat me”信號(hào)，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。阻斷CD47-SIRPα通路可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，同時(shí)還可以提高腫瘤特異性抗原的免疫遞呈，激活特異性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，達(dá)到同時(shí)激活固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的效果。
　　本課題主要圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)，一方面嘗試?yán)么笕萘靠贵w庫(kù)篩選技術(shù)獲得抗OX40激動(dòng)型抗體，為腫瘤的免疫治療提供新的候選分子；另一方面針對(duì)已經(jīng)獲得的一株抗CD47功能抗體，探索其與其它靶

4、向抗體聯(lián)合抗腫瘤的應(yīng)用。
　　本課題的第一部分是圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的發(fā)現(xiàn)，以 T細(xì)胞表面共刺激分子OX40為靶點(diǎn)，篩選抗OX40單抗并進(jìn)行初步鑒定。依托已構(gòu)建的大容量全合成全人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)平臺(tái)，以O(shè)X40為抗原進(jìn)行多輪多次的固相篩選。經(jīng)過(guò)3輪條件漸進(jìn)嚴(yán)苛的篩選后，得到8株陽(yáng)性克隆，其中一株得到極好的富集；所有陽(yáng)性克隆通過(guò)基因工程改造成全抗體形式，形成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒按照一定的比例轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行全抗體的瞬時(shí)

5、表達(dá)；并基于AKTA系統(tǒng)對(duì)全抗體進(jìn)行純化。之后分別通過(guò)以下方法驗(yàn)證了全抗體的特性。第一，通過(guò)ELISA驗(yàn)證了全抗體與抗原OX40在分子水平上的結(jié)合活性；第二，通過(guò)間接免疫熒光驗(yàn)證了全抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性；第三，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了全抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性；第四，采用ELISA方法測(cè)定了全抗體的特異性；第五，通過(guò)血清放置實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了全抗體的血清穩(wěn)定性；第六，通過(guò)BIAcoreTM3000初步測(cè)定了全抗體親和力。

6、　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)3輪噬菌體單鏈抗體庫(kù)固相篩選后，得到8株陽(yáng)性單鏈抗體，scFv-1在篩選過(guò)程中富集率達(dá)到了95％；8株中有5株順利改造成全抗體并表達(dá)純化。對(duì)各抗體分子的特性進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，OX40mab-4、OX40mab-8與抗原的結(jié)合活性較差，OX40mab-5、OX40mab-6的特異性較差，因此這4株抗體在鑒定過(guò)程中被逐漸淘汰。相比于其他4株抗體，OX40mab-1具有較好的結(jié)合活性，與OX40結(jié)合的EC50為0.015μM

7、，特異性、血清穩(wěn)定性也較好，親和力為251 nM。因此確定OX40mab-1作為后續(xù)研究的候選抗體分子。
　　本課題的第二部分是圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的評(píng)價(jià)，以本室已獲得的一株高親和力全人源抗CD47特異性抗體AMMS4-G4為研究對(duì)象，探究該抗體在腫瘤模型體內(nèi)聯(lián)合其他靶向抗體的藥效。該抗體可以阻斷CD47-SIRPα的結(jié)合，并且能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。體內(nèi)試驗(yàn)已證實(shí)該抗體獨(dú)立給藥時(shí)，能夠顯著延長(zhǎng)白血病模型小鼠的

8、生存期，有效清除模型動(dòng)物體內(nèi)的白血病細(xì)胞；因此，本課題基于以上研究背景，探究了AMMS4-G4在腫瘤小鼠模型中聯(lián)合其他靶向抗體聯(lián)合用藥的藥效，期望能夠探索出此抗體在腫瘤應(yīng)用中的新方法，為臨床治療奠定基礎(chǔ)。
　　本課題選擇了三種聯(lián)合靶向抗體：A2C1、Herceptin和Rituximab。A2C1是本室獲得的另一株靶向人EGFR的阻斷型抗體，正在開展針對(duì)人結(jié)直腸癌的臨床試驗(yàn)；Herceptin是一株靶向人HER2的人源化單抗，臨床

9、上主要用于治療HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌；Rituximab是一株靶向人CD20的人鼠嵌合單抗，臨床上主要用于治療CD20陽(yáng)性的非霍奇金淋巴瘤?；贏MMS4-G4和上述三種靶向抗體的特性，本課題構(gòu)建了以下腫瘤動(dòng)物模型。分別是同時(shí)表達(dá)人CD47和EGFR的人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo荷瘤裸鼠模型；同時(shí)表達(dá)人CD47和HER2的人卵巢癌細(xì)胞Skov3荷瘤裸鼠模型；同時(shí)表達(dá)人CD47和CD20的淋巴瘤Raji腫瘤模型，分別用于考察AMMS4-G4和

10、A2C1、Herceptin和Rituximab聯(lián)合用藥的治療效果?？笴D47治療性抗體聯(lián)合用藥藥效評(píng)價(jià)主要從以下幾個(gè)方面展開。第一，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了抗體與腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原的結(jié)合；第二，小鼠接種腫瘤細(xì)胞、分組、建立荷瘤小鼠模型；第三，建模成功的荷瘤小鼠模型分組給藥、測(cè)量腫瘤體積、觀察臨床癥狀；第四，根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)情況，停止給藥并繼續(xù)觀察，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，對(duì)腫瘤重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥藥效結(jié)果。第五，初步探究荷瘤小鼠模型

11、聯(lián)合用藥的藥效學(xué)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Lovo荷瘤裸鼠模型上，低劑量（即12.5 mg/kg）A2C1、AMMS4-G4聯(lián)合給藥時(shí)相比A2C1、AMMS4-G4任一抗體單獨(dú)給藥腫瘤重量明顯下降，腫瘤體積明顯減小，說(shuō)明聯(lián)合用藥具有更好的藥效；同時(shí)，高劑量（即25 mg/kg）A2C1、AMMS4-G4聯(lián)合給藥組雖然與A2C1單給藥組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯，但仍可見有更好的抑瘤趨勢(shì)。對(duì)A2C1、AMMS4-G4的聯(lián)合用藥機(jī)制進(jìn)行探究發(fā)

12、現(xiàn)，抗EGFR抗體A2C1有可能協(xié)同抗CD47抗體AMMS4-G4下調(diào)Lovo腫瘤組織中CD47的含量；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，AMMS4-G4可能具有與A2C1同樣的腫瘤組織內(nèi)蓄積作用。在Skov3荷瘤模型中，雖然Herceptin、AMMS4-G4聯(lián)合給藥相比Herceptin、AMMS4-G4任一抗體單獨(dú)給藥藥效并無(wú)顯著改善，但從趨勢(shì)上講聯(lián)合用藥仍具有一定優(yōu)勢(shì)，而且研究還發(fā)現(xiàn)AMMS4-G4單用時(shí)藥效顯著好于對(duì)照抗體huIgG，與商業(yè)化抗

13、體Herceptin藥效相當(dāng)。同樣在Raji荷瘤模型中，AMMS4-G4單用時(shí)藥效良好，且能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞向骨髓轉(zhuǎn)移。
　　綜上所述，本課題在抗腫瘤單抗藥物的發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)方面做了兩方面工作，第一，篩選靶向T細(xì)胞表面的共刺激分子OX40的單克隆抗體。通過(guò)3輪篩選后得到一株與抗原結(jié)合活性較好，特異性、血清穩(wěn)定性較好，親和力為251 nM的抗OX40單抗分子，為腫瘤免疫治療提供新的候選分子。第二，針對(duì)已經(jīng)獲得的一株抗CD47功能抗體A