曲妥珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑治療胃癌的體外研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，其死亡率居各類腫瘤死亡率第一位。雖然根治性手術(shù)后早期胃癌的5年生存率超過(guò)90％，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處晚期，治療主要以化療為主。常用的化療藥物包括鉑類、紫杉、蒽環(huán)類、氟脲嘧啶等。由于細(xì)胞毒性藥物存在的副作用及耐藥性的發(fā)生，制約著化療療效的發(fā)揮。總體療效仍不理想。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，胃癌的靶向治療成為研究熱點(diǎn)。HER2被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生

2、、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。胃癌中HER2的表達(dá)率在6～35％，并且HER2陽(yáng)性胃癌侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差。
　　針對(duì)HER2的特異性單克隆抗體曲妥珠單抗可通過(guò)與細(xì)胞膜表面的HER2結(jié)合而發(fā)揮抗腫瘤作用，已經(jīng)成為HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。在乳腺癌中HER2相關(guān)的基礎(chǔ)研究、臨床報(bào)道很多，作用機(jī)制比較明確。曲妥珠單抗已知的作用機(jī)制包括:1、阻斷HER2介導(dǎo)的PI3K及MAPK信號(hào)通路活化，引起G0/G1期阻滯;2、使非受體型的酪氨酸激酶

3、Src與HER2解離并失活，繼而PTEN去磷酸化，轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜部位而活化，其下游的PI3K-AKT-mTOR受抑制;3、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，其Fc段與表達(dá)Fc受體的NK細(xì)胞結(jié)合，通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡;4、抑制血管形成，減少微血管密度，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
　　由于胃癌中也部分存在HER2的高表達(dá)，鑒于曲妥珠單抗在治療乳腺癌中的成功經(jīng)驗(yàn)，Ⅲ期臨床試驗(yàn)ToGA中對(duì)比了曲妥珠單抗聯(lián)合化療與化療單用在

4、HER2陽(yáng)性進(jìn)展期胃癌中的療效。首次將晚期胃癌的總生存提高到了1年以上。（曲妥珠聯(lián)合化療組13.5個(gè)月對(duì)比單純化療組11.1個(gè)月）。隨后NCCN在2010年推薦對(duì)進(jìn)展期胃癌及胃食管結(jié)合部癌進(jìn)行HER2檢測(cè)及對(duì)HER2陽(yáng)性者進(jìn)行曲妥珠單抗與化療聯(lián)合的系統(tǒng)性治療。
　　而對(duì)于曲妥珠單抗與化療聯(lián)合用于胃癌的基礎(chǔ)研究尚少，曲妥珠單抗能否抑制胃癌細(xì)胞增殖目前結(jié)果尚不一致。而且晚期胃癌無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，在眾多應(yīng)用的化療藥物中，是否存在最佳的與

5、曲妥珠單抗聯(lián)合的方案需要研究證實(shí)。且目前與曲妥珠單抗聯(lián)合的順鉑/氟脲嘧啶方案中，順鉑的療效常常由于耐藥的發(fā)生而受限制。奧沙利鉑是第三代的鉑類復(fù)合物，研究表明奧沙利鉑與順鉑無(wú)交叉耐藥。在目前指南的推薦中，奧沙利鉑與順鉑可根據(jù)毒副反應(yīng)的不同替換使用。奧沙利鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合的目前僅有一篇基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)具有相加或協(xié)同的作用。奧沙利鉑為主的方案常用的胃癌化療方案，它是否同樣適合與曲妥珠單抗聯(lián)用于HER2陽(yáng)性胃癌的治療，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

6、r>　　材料與方法：
　　1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)。
　　2、MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析及凋亡判定。
　　4、Western blot檢測(cè)HER2下游p-AKT、p-ERK及ERCC1、GSTπ等相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以(x)±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，細(xì)胞周期分析采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

7、br>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、HER2表達(dá)對(duì)奧沙利鉑抑制胃癌細(xì)胞增殖作用的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞株表面HER2表達(dá)。在所選四種細(xì)胞系中，胃癌細(xì)胞NCI-N87及乳腺癌細(xì)胞BT474 HER2表達(dá)為陽(yáng)性，胃癌細(xì)胞MGC803和乳腺癌細(xì)胞MCF7 HER2表達(dá)為陰性。
　　曲妥珠單藥作用于HER2陽(yáng)性細(xì)胞系96 h，最大抑制率可達(dá)20％，未顯示出明顯的濃度依賴性，在隨后的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)中，采用抑制率達(dá)平臺(tái)期的10μg/

8、ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在MTT實(shí)驗(yàn)中，HER2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞與陰性細(xì)胞相比，對(duì)奧沙利鉑相對(duì)耐藥，其中奧沙利鉑在NCI-N87中48 h、96 h的IC50值分別為MGC803的20倍和15倍;而在BT474中48 h、96 h的IC50值分別為MCF7的9倍和7倍。在聯(lián)用曲妥珠單抗后，HER2陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)半數(shù)抑制時(shí)奧沙利鉑濃度明顯下降，而在HER2陰性細(xì)胞達(dá)半數(shù)抑制時(shí)奧沙利鉑濃度無(wú)明顯變化。其中，BT474中，曲妥珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑作用48

9、h后，細(xì)胞達(dá)半抑制時(shí)奧沙利鉑的濃度由6.66μg/ml降為5.94μg/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮原因?yàn)锽T474細(xì)胞倍增時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于48 h，所以在作用48 h時(shí)細(xì)胞未達(dá)到一次倍增，曲妥珠單抗的抑制增殖作用尚未完全發(fā)揮。
　　2、兩藥聯(lián)合對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞凋亡的影響
　　流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測(cè)兩藥作用后細(xì)胞凋亡的變化。采用奧沙利鉑5μg/m1和25μg/ml與曲妥珠單抗10μg/ml分別單用及聯(lián)合作用48 h、96 h，發(fā)

10、現(xiàn)聯(lián)合作用后凋亡率較兩單藥作用時(shí)增加。在NCI-N87中，25μg/ml奧沙利鉑單藥作用48h凋亡率為6.8％，加用曲妥珠單抗后達(dá)9.1％，單藥奧沙利鉑作用96 h凋亡率9.1％，加用曲妥珠單抗后增加到15.8％。而B(niǎo)T474相對(duì)于NCI-N87更敏感，25μg/ml奧沙利鉑單藥作用48 h凋亡率為25.8％，聯(lián)用曲妥珠單抗后達(dá)35.7％，單藥奧沙利鉑作用96 h凋亡率為35.6％，加用曲妥珠單抗后增加至68％。在Western blo

11、t檢測(cè)PARP裂解顯示相加的效果。
　　3、曲妥珠單抗與奧沙利鉑聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　10μg/ml曲妥珠單抗作用48 h后，引起明顯的G0/G1期阻滯，N87細(xì)胞G1期細(xì)胞由62.94％增至74.22％，而S期細(xì)胞比例明顯減少，由26.47％降至17.1％;BT474中G1期細(xì)胞由74.61％增至84.87％，S期細(xì)胞由11.36％減少至3.39％。奧沙利鉑25μg/ml單獨(dú)作用48 h，引起S期阻滯，NCI-N87中

12、S期細(xì)胞比例由26.47％增加到33.7％，BT474中S期細(xì)胞比例由11.36％增至28.55％。二者聯(lián)用時(shí)，以S期阻滯為主，并且G2/M期細(xì)胞減少更明顯，NCI-N87中由對(duì)照組的10.59％減少至2.82％，BT474細(xì)胞中與對(duì)照組的14.03％相比，減少至4.27％。
　　4、曲妥珠單抗單藥10μg/ml作用在6h內(nèi)對(duì)p-AKT及p-ERK有輕度短暫的上調(diào)，隨后可呈時(shí)間依賴性下調(diào)p-AKT及p-ERK，奧沙利鉑對(duì)p-AKT

13、及p-ERK也表現(xiàn)出抑制作用。二者聯(lián)合時(shí)，對(duì)p-AKT的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。而對(duì)于p-ERK的聯(lián)合抑制作用，僅在BT474細(xì)胞中表現(xiàn)明顯。
　　5、曲妥珠單藥10μg/ml作用0～96 h，對(duì)GSTπ表達(dá)無(wú)影響。而對(duì)ERCC1在6h內(nèi)短暫上調(diào)，作用12h開(kāi)始以時(shí)間依賴性下調(diào)。與奧沙利鉑聯(lián)合時(shí)，對(duì)ERCC1的下調(diào)作用顯著。提示曲妥珠單抗通過(guò)此作用減少DNA修復(fù)增強(qiáng)奧沙利鉑的療效。
　　結(jié)論：
　　1、曲妥珠單抗可增加HE