奧沙利鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞壞死的機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，手術(shù)和化療是主要的治療方式。在各種化療藥物中，鉑類是胃癌治療的常用藥物，如順鉑、奧沙利鉑，它們屬于DNA烷化劑，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)形成鉑類-DNA加合物，導(dǎo)致DNA發(fā)生鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，損傷 DNA。一般認(rèn)為 DNA損傷是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性的凋亡途徑而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的，然而越來(lái)越多的證據(jù)表明鉑類藥物的作用機(jī)制可能不止是凋亡，壞死也可能參與其中。長(zhǎng)久以來(lái)壞死被認(rèn)為是由外界壓倒性刺激因素引起的被

2、動(dòng)的、意外的、無(wú)序的死亡方式，和凋亡的有序調(diào)控相比，其作用一直被忽視。2005年，Degterev等在小鼠缺血再灌注損傷模型中提出程序性壞死（necroptosis）的概念，并鑒定出一種特異的抑制劑 necrostatin-1（Nec-1），顛覆了人們對(duì)壞死的認(rèn)識(shí)。這十年里，程序性壞死被發(fā)現(xiàn)參與了許多病理生理過(guò)程，且多種因素都可以引起程序性壞死的發(fā)生。盡管目前對(duì)它的信號(hào)通路還不清楚，但是也取得了一些成果，其中最主要的是腫瘤壞死因子家族引

3、起的受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase3，RIP3）依賴的途徑和DNA烷化劑引起的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly[ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1）介導(dǎo)的途徑。在前期的工作中，我們使用Nec-1這個(gè)工具，發(fā)現(xiàn)它能顯著地抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的SGC-7901胃癌細(xì)胞死亡，這令我們相信奧沙利鉑作用后引起的主要是壞死。本研究擬探索奧沙利鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡

4、的方式，尤其是壞死在其中的作用，剖析RIP3依賴的途徑和PARP-1介導(dǎo)的途徑在其中的參與情況。凋亡和壞死可能是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡中普遍存在的兩種結(jié)局，相對(duì)于研究得非常透徹的凋亡，壞死無(wú)疑是個(gè)新的未知領(lǐng)域。弄清楚壞死的發(fā)生過(guò)程，明確它和凋亡之間的關(guān)聯(lián)，找到更有效地殺死腫瘤細(xì)胞的辦法，將為克服腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗提供新思路。
　　方法：Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死；Hoechst33342/PI

5、染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核和細(xì)胞膜的變化；JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體膜電位的改變；Western blot檢測(cè)caspase-9、caspase-3、PARP-1的活化以及抗凋亡的Bcl-2家族蛋白和IAP家族蛋白的變化；提取細(xì)胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA ladder是否出現(xiàn)；比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性；Western blot檢測(cè)CypA和HMGB1的釋放；透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；DCF-DA染色流式細(xì)胞術(shù)檢

6、測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；Western blot檢測(cè)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變；實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)Bmf在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；MTS法檢測(cè)RIP1的抑制劑（Nec-1）、MLKL抑制劑（NSA）、Drp1抑制劑（Mdivi-1）、廣譜caspases抑制劑（z-VAD-fmk）和PARP-1抑制劑（olaparib）對(duì)奧沙利鉑所致SGC-7901細(xì)胞死亡的影響；轉(zhuǎn)染RIP1 siRNA、RIP3 si

7、RNA和PARP-1 siRNA后用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞死亡的影響；熒光顯微鏡和Western blot方法觀察PAR的形成和H2AX的磷酸化；比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平；熒光素/熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞的ATP水平；激光共聚焦顯微鏡和Western blot方法觀察tAIF的移位；Western blot檢測(cè)奧沙利鉑作用早期p38、JNK和ERK1/2的磷酸化（活化）情況；MT

8、S法檢測(cè)分別用p38抑制劑 SB203580、JNK抑制劑SP600125或位于ERK1/2上游的激酶MEK1/2抑制劑U0126預(yù)處理對(duì)奧沙利鉑所致細(xì)胞死亡的影響。
　　結(jié)果：奧沙利鉑處理SGC-7901細(xì)胞后，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為Annexin V（+）/PI（+），少數(shù)為Annexin V（+）/PI（?）；Hoechst33342/PI染色見(jiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂，紅色熒光出現(xiàn)，說(shuō)明細(xì)胞膜破裂；瓊脂糖凝膠電泳沒(méi)有觀察到DNA lad

9、der，只是在48 h出現(xiàn)彌散狀的條帶；線粒體膜電位隨著奧沙利鉑作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降；caspase-9、caspase-3的活化和PARP-1的裂解出現(xiàn)在奧沙利鉑作用24 h后；Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、cIAP1和cIAP2在奧沙利鉑處理前后沒(méi)有明顯改變，唯有 XIAP有所下降；z-VAD-fmk能部分地抑制奧沙利鉑引起的細(xì)胞死亡；奧沙利鉑處理36 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性顯著升高；CypA在處理后36 h釋放入

10、上清，比HMGB1要早；透射電鏡觀察到細(xì)胞膜完整性喪失、細(xì)胞內(nèi)容物外漏、染色質(zhì)固縮；壞死過(guò)程不伴有ROS的升高和自噬的發(fā)生，而Bmf在mRNA和蛋白水平均逐漸升高；Nec-1能顯著地抑制奧沙利鉑所致的細(xì)胞死亡，能使細(xì)胞存活率達(dá)到90％以上，而NSA或Mdivi-1對(duì)細(xì)胞死亡無(wú)影響；Nec-1還能抑制LDH和CypA、HMGB1釋放入上清；轉(zhuǎn)染RIP1 siRNA后能部分抑制奧沙利鉑引起的細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)染RIP3 siRNA對(duì)細(xì)胞死亡無(wú)影

11、響；大分子聚合物PAR在奧沙利鉑作用后形成；細(xì)胞內(nèi) NAD+和ATP水平隨著奧沙利鉑作用時(shí)間延長(zhǎng)而快速下降；奧沙利鉑引起組蛋白H2AX在Ser139位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；tAIF在奧沙利鉑處理后從線粒體移出，進(jìn)入細(xì)胞漿，最終進(jìn)入細(xì)胞核；olaparib能通過(guò)抑制PARP-1的活化而抵抗奧沙利鉑所致的細(xì)胞死亡，并能阻止LDH釋放、NAD+和ATP的下降以及tAIF的移位；轉(zhuǎn)染PARP-1 siRNA也能抑制奧沙利鉑引起的細(xì)胞壞死；奧沙利鉑處理6

12、 h后p38發(fā)生磷酸化，而ERK1/2和JNK在未處理的SGC-7901細(xì)胞中就處于磷酸化狀態(tài)，奧沙利鉑處理6 h后pERK1/2降低，pJNK沒(méi)有明顯的變化；U0126或SB203580預(yù)處理可以增加細(xì)胞存活率，而SP600125對(duì)奧沙利鉑所致的細(xì)胞死亡無(wú)影響。
　　結(jié)論：奧沙利鉑能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生凋亡和壞死；盡管caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，但caspase活化的程度有限，凋亡似乎是可有可無(wú)的，而壞死才是主要的

13、死亡方式；這種壞死不伴有ROS的升高和自噬的發(fā)生，但卻可以上調(diào)Bmf的表達(dá)；RIP1是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，Nec-1幾乎能完全阻止細(xì)胞死亡；RIP3及其下游的MLKL、PGAM5以及Drp1并不參與壞死信號(hào)傳導(dǎo)；奧沙利鉑通過(guò)激活PARP-1而消耗細(xì)胞內(nèi)的能量是導(dǎo)致壞死的原因，抑制PARP-1就可以抑制壞死的發(fā)生；H2AX在Ser139位點(diǎn)發(fā)生磷酸化和tAIF從線粒體移位到細(xì)胞核參與了奧沙利鉑引起的SGC-7901細(xì)胞壞死過(guò)程；JNK