Dasatinib聯(lián)合奧沙利鉑協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞增殖.pdf

1、背景與目的：胃癌發(fā)病率和死亡率高，我國(guó)早期診斷率不足10％。以手術(shù)為主，輔以化療、放療、乃至生物靶向治療等在內(nèi)的多學(xué)科綜合治療成為目前公認(rèn)的進(jìn)展期胃癌治療模式。奧沙利鉑在胃癌的化療中占據(jù)重要地位，防止或逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥備受關(guān)注。本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞Src酪氨酸激酶活性的影響，以及Src酪氨酸激酶抑制劑Dasatinib聯(lián)合奧沙利鉑抑制胃癌細(xì)胞增殖與遷移等惡性生物學(xué)行為的效應(yīng)。
　　方法：①實(shí)時(shí)-聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

2、應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western Blot）技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中Src及其活性形式p-Src的基礎(chǔ)表達(dá)；②Western Blot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間或不同劑量奧沙利鉑作用于胃癌細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞內(nèi)Src及p-Src的變化規(guī)律；③通過(guò)CCK-8體外增殖實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)胃癌細(xì)胞暴露于不同濃度奧沙利鉑和Dasatinib后的生長(zhǎng)抑制率，并分別計(jì)算兩種藥物的 IC50，使用 Calcusyn2.0軟件計(jì)算聯(lián)合作用指數(shù) CI（combin

3、ation indices）；④通過(guò)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察上述藥物對(duì)胃癌細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移的影響。⑤建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，分別用奧沙利鉑和/或Dasatinib作用于裸鼠，觀察不同藥物處理對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。免疫組織化學(xué)染色（IHC）和Western Blot技術(shù)，分析不同處理組間Src，p-Src，Ki-67等蛋白的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：①10株胃癌細(xì)胞及一株胃粘膜上皮細(xì)胞

4、中，SGC-7901、BGC-823、MKN-28細(xì)胞株的p-Src/Src基礎(chǔ)表達(dá)比值較高；②奧沙利鉑可明顯上調(diào)胃癌細(xì)胞 p-Src表達(dá)，呈時(shí)間依賴性，但未顯示劑量依賴性；③低濃度Dasatinib（5nmol/L）作用2h即可幾乎完全抑制胃癌細(xì)胞內(nèi)p-Src表達(dá)水平；④Dasatinib和奧沙利鉑在胃癌細(xì)胞中的聯(lián)合作用指數(shù)CI值均小于1，且對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)明顯高于單藥組，提示可協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)；⑤每鏡下視野的胃癌細(xì)胞克隆

5、形成數(shù)，對(duì)照組、奧沙利鉑組、Dasatinib組、兩藥聯(lián)合組分別為（24±3.6）個(gè)、（16±1.5）個(gè)、（19±1.7）個(gè)和（10±0.6）個(gè)，兩藥聯(lián)合組較奧沙利鉑組、Dasatinib組克隆形成數(shù)目減少（P=0.013和P=0.011）；⑥劃痕愈合寬度在對(duì)照組、奧沙利鉑組、Dasatinib組、兩藥聯(lián)合組分別為（220±27.1）μm、（189±18.6）μm、（95±17.5）μm和（43±17.3）μm。兩藥聯(lián)合組劃痕愈合能力明

6、顯低于奧沙利鉑組和Dasatinib組（P=0.000和P=0.012）；⑦Dasatinib作用后，胃癌細(xì)胞皺縮、變圓、變小，但細(xì)胞數(shù)目未見(jiàn)明顯減少；⑧Dasatinib單藥對(duì)胃癌細(xì)胞周期影響不明顯，但聯(lián)合奧沙利鉑后對(duì)比奧沙利鉑單藥組，G1期細(xì)胞數(shù)目增多（P=0.002），S期和 G2期細(xì)胞數(shù)目減少（P=0.02）；⑨對(duì)照組、奧沙利鉑組、Dasatinib組、兩藥聯(lián)合組的裸鼠移植瘤瘤重分別為（3.29±0.52）g、（1.75±0.2

7、2）g、（3.08±0.47）g、（0.56±0.26）g，兩藥聯(lián)合組瘤重明顯低于奧沙利鉑組和Dasatinib組（P=0.013和P=0.009）；IHC結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ki-67表達(dá)減少；奧沙利鉑組移植瘤組織p-Src表達(dá)升高，而聯(lián)合用藥組p-Src表達(dá)明顯低于單藥組；不同組間的Src蛋白表達(dá)未見(jiàn)差異。
　　結(jié)論：奧沙利鉑可上調(diào)胃癌細(xì)胞p-Src表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性；Src酪氨酸激酶抑制劑 Dasatinib聯(lián)合奧沙利鉑可