過載力誘導三維培養(yǎng)成骨細胞凋亡模型建立及野薔薇苷保護作用研究.pdf

1、第一部分：過載力誘導成骨細胞凋亡模型的建立
　　目的：通過探究過載力持續(xù)時間及加載周期對成骨細胞凋亡的影響，建立應力性骨折的成骨細胞凋亡模型。
　　方法：
　　1.實驗分組：將生長狀況良好的細胞支架復合物分為7組：對照組，每天加載0.5h持續(xù)4d組，每天加載0.5h持續(xù)8d組，每天加載0.5h持續(xù)12d組，每天加載2h持續(xù)4d組，每天加載2h持續(xù)8d組，每天加載2h持續(xù)12d組。
　　2.有限元分析細胞支架復合物

2、受力分布情況。
　　3.Hoechst/PI熒光雙染法觀察支架-細胞復合物成骨細胞凋亡情況。
　　4.采用CCK-8試劑盒檢測三維培養(yǎng)成骨細胞增殖活性。
　　5.采用AKP、LDH和Caspase-3活性檢測試劑盒測定成骨細胞分化、乳酸脫氫酶的外漏量及凋亡標志物Caspase-3活性。
　　6.Realtime RT-PCR方法檢測Caspase-3,9的基因表達水平。
　　7.Western Blot方法

3、檢測Caspase-3,9的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.當表觀應變?yōu)?0000με時，4000με以上應變占60％，因此在三維過載力學培養(yǎng)環(huán)節(jié)，選擇表觀應變?yōu)?0000με的力學加載強度。
　　2.在熒光顯微鏡下可觀察到，對照組細胞偶見紅染細胞；每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組以及每天加載2h持續(xù)4d組細胞核形態(tài)與對照組大致相同，可見少量紅色死亡細胞；每天加載0.5h持續(xù)12d以及每天加載2h持續(xù)8d和12d組可見

4、凋亡小體并且可見大量紅色死亡細胞。
　　3.每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組和每天加載2h持續(xù)4d組，CCK-8檢測OD值顯著升高（P<0.05），而每天加載0.5h，持續(xù)12d組和每天加載2h，持續(xù)8d、12d組，OD值顯著下降（P<0.05）。力學加載前8d，每天加載0.5h組OD值明顯高于2h組（P<0.05），而加載至12d時，兩組別無顯著性差異（P>0.05）。
　　4.正常對照組與0.5h、2h組 AKP表達量有

5、顯著性差異（P<0.05），0.5h組與2h組之間 AKP表達量無顯著性差異（P>0.05）；4d、8d、12d與0d相比 AKP表達量均升高，4d與8d之間表達量無統(tǒng)計學差異（P>0.05），而12d比其余組均升高（P<0.05）。
　　5.正常對照組、0.5h及2h三組LDH外漏量均有顯著性差異（P<0.05），2h組明顯高于正常對照組和0.5h組；0、4、8、12d四組LDH外漏量均有顯著性差異（P<0.05）。
　　

6、6.與加載0d組相比，除每天加載0.5h，持續(xù)4d組之外，其余各組Caspase-3活性均升高（P<0.05）；持續(xù)加載至第4天時，每天加載2h組Caspase-3活性顯著高于0.5h組（P<0.05），其余每天兩時間點間均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；0.5h組在第8天開始 Caspase-3活性顯著升高，在第12天與2h組無差異。
　　7.與正常對照組相比，各力學加載組 caspase-3基因表達量明顯升高（P<0.05），加

7、載4d時每天加載2h組caspase-3基因表達量明顯高于每天加載0.5h組；與正常對照組相比，各力學加載組caspase-9基因表達量明顯升高（P<0.05），加載8d時每天加載2h組caspase-9基因表達量明顯高于每天加載0.5h組。
　　8.與正常對照組相比，模型組加載第8、12天，caspase-9、caspase-3蛋白表達量明顯升高，且每天加載2h各組蛋白表達量明顯高于每天加載0.5h組。
　　第二部分：過載

8、力誘導成骨細胞凋亡的機制研究
　　目的：通過研究過載力作用下細胞膜上鈣離子通道、細胞外 ATP濃度對細胞內(nèi)鈣離子濃度及細胞凋亡的影響，探討應力性骨折的發(fā)病機制。
　　方法：
　　1.實驗分組：隨機取生長狀況良好的細胞支架復合物分為不受力組（正常對照組（分化誘導培養(yǎng)基），加入維拉帕米組（分化誘導培養(yǎng)基）， Hank?s培養(yǎng)基對照組，Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組），過載力加載1天組（分化誘導培養(yǎng)基組，Hank?s培養(yǎng)基

9、組，分化誘導培養(yǎng)基加入維拉帕米組，Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組），過載力加載8天組（分化誘導培養(yǎng)基，分化誘導培養(yǎng)基加入維拉帕米組，分化誘導培養(yǎng)基加入NEM組）。
　　2.Fluo-4-AM熒光標記法測定細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。
　　3.ATP活性測定試劑盒測定細胞外ATP活性。
　　4.Realtime RT-PCR方法測定 Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因表達量。
　　5.Wes

10、tern Blot方法測定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達量。
　　結(jié)果：
　　1.每天加載過載力2h，第一天細胞內(nèi)游離鈣離子濃度及細胞外 ATP含量均顯著高于正常對照組（P<0.05），第二天ATP含量與正常對照組無顯著性差異（P>0.05），第三天開始 ATP含量顯著低于正常對照組（P<0.05）。除第四天外，其余各時間點細胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著升高（P<0.05），且呈時間依賴趨勢。<

11、br>　　2.過載力作用1d，細胞內(nèi)鈣離子濃度和ATP含量顯著升高，加入細胞胞吐作用抑制劑NEM可以顯著抑制這種效應。加入鈣離子通道阻斷劑維拉帕米（細胞膜上）可以降低細胞外 ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度（P<0.05）。
　　3.過載力作用第8天，加入NEM對細胞外ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度影響與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；但加入維拉帕米后，細胞外ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度與對照組相比顯著降低（P<0.05）。

12、r>　　4.過載力作用第8天，細胞Caspase-3，Caspase-9以及Bax/Bcl-2比值的蛋白及mRNA表達量均顯著高于正常對照組（P<0.05），維拉帕米可以顯著下調(diào)在過載力環(huán)境下的細胞內(nèi)凋亡基因及蛋白的表達（P<0.05），但對正常細胞無顯著影響。
　　第三部分：野薔薇苷對抗過載力誘導的成骨細胞凋亡及機制
　　目的：通過研究過載力作用下細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，探討野薔薇苷對抗過載力刺激導致的細胞凋亡的作用及機制

13、。
　　方法：
　　1.實驗分組：本部分實驗在研究不同濃度野薔薇苷對過載力誘導的成骨細胞凋亡模型的作用時，將生長狀況良好的細胞支架復合物分為6組，分別為：正常對照組（不加力），過載力加載模型組，野薔薇苷濃度為1×10-6 mol/L組、1×10-8 mol/L組、1×10-10 mol/L組和1×10-12 mol/L組，均在力學加載裝置中加載10000με每天2h，持續(xù)8d；在研究野薔薇苷對抗過載力誘導的成骨細胞凋亡機制時

14、，將生長狀況良好的細胞支架復合物分為4組，分別為正常對照組，過載力加載模型組，維拉帕米(1×10-8 mol/L)組，野薔薇苷(1×10-8 mol/L)組，對照組不做力學加載，在同樣條件下培養(yǎng)8d，其余3組均在力學加載裝置中加載10000με每天2h，持續(xù)8d。
　　2.Hoechst/PI熒光雙染法觀察野薔薇苷抗凋亡作用。
　　3.采用CCK-8方法測定OD值評價細胞增殖情況。
　　4.測定Caspase-3活性評

15、價野薔薇苷抗凋亡基因活化情況。
　　5.測定LDH外漏量評價不同條件下細胞損傷情況。
　　6.測定細胞內(nèi)游離鈣離子濃度評價野薔薇苷抗凋亡機制。
　　7.Realtime RT-PCR方法測定細胞內(nèi) Caspase-9, Caspase-3, Bcl-2和Bax基因表達情況。
　　8.Western Blot方法測定細胞內(nèi) Caspase-9, Caspase-3, Cyt-C, Bcl-2和Bax蛋白表達情況。<

16、br>　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下可見，正常對照組細胞偶見紅染細胞；過載力加載模型組可見細胞核皺縮，細胞形狀不規(guī)整，出現(xiàn)凋亡小體并且可見大量紅染細胞；與模型組相比，各加藥組尤其是野薔薇苷1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組紅染細胞數(shù)量明顯減少。
　　2.與對照組相比，過載力加載模型組顯著降低（P<0.05），與模型組相比，各濃度野薔薇苷均能顯著升高細胞活力（P<0.05），其中1×10-10 mol/L

17、組最高。
　　3.各濃度野薔薇苷組LDH值均顯著低于模型組（P<0.05）。
　　4.與對照組相比，過載力加載模型組 Caspase-3活性顯著升高（P<0.05）；加入野薔薇苷可明顯降低Caspase-3活化程度（P<0.05）；其中1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組Caspase-3活性低于1×10-6 mol/L和1×10-12 mol/L組。
　　5.與對照組相比，過載力加載模型組 Casp

18、ase-3和 Caspase-9 mRNA及其蛋白水平明顯升高（P<0.05）；加入野薔薇苷后Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白水平明顯降低（P<0.05）。
　　6.與對照組相比，過載力加載模型組細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高（P<0.05），維拉帕米和野薔薇苷均能阻止細胞內(nèi)鈣離子升高（P<0.05）。
　　7.與對照組相比，過載力加載模型組Caspase-3, Caspase-9 mRNA表達水平以及Bax

19、/Bcl-2的比值均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，維拉帕米組除Caspase-9外，其余均顯著性降低（P<0.05）；野薔薇苷組Caspase-3, Caspase-9 mRNA表達水平以及Bax/Bcl-2的比值與模型組均顯著性降低（P<0.05）。
　　8.與對照組相比，過載力加載模型組細胞 Caspase-3, Caspase-9, Bax及Cyt-C蛋白水平顯著升高，Bcl-2顯著降低；與模型組相比，維拉帕米組和

20、野薔薇苷組Caspase-3, Caspase-9, Bax及Cyt-C蛋白水平顯著降低， Bcl-2蛋白水平顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1.過載力刺激對成骨細胞有“雙向刺激”作用，短期作用能刺激成骨細胞增殖分化，長期作用則導致成骨細胞凋亡。
　　2.短期過載力刺激促進細胞膜上鈣離子通道的開放和促進 ATP向基質(zhì)分泌，共同促進細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，長期過載力刺激僅作用于細胞膜上鈣離子通道的開放導致細胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載。