仙茅苷通過(guò)FoxO1保護(hù)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制及體內(nèi)代謝研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是以骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病，可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加。在骨代謝中，過(guò)量ROS引起破骨細(xì)胞骨吸收增加，成骨細(xì)胞骨形成減少，骨代謝的平衡被破壞，造成骨量丟失、骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
　　中藥仙茅來(lái)源于石蒜科植物仙茅（CG）的干燥根莖，能夠強(qiáng)筋骨、抗衰老、益精血，是著名的補(bǔ)腎中藥。仙茅苷為仙茅中主要活性成分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗骨質(zhì)疏松、抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。課題組前期研究采用活性炭處理的

2、血清和無(wú)酚紅培養(yǎng)基建立的成骨細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)仙茅苷無(wú)明顯的雌激素樣作用;通過(guò)復(fù)制小鼠鐵超載氧化應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高鐵超載小鼠的骨密度，調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明仙茅苷能夠保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的骨組織，但作用機(jī)制尚不清楚。另一方面，仙茅苷屬于苯甲酸酯類(lèi)酚苷，口服絕對(duì)生物利用度較低，仙茅苷的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有待闡明。因此，本課題研究了仙茅苷保護(hù)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，并明確了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。
　　本課題采用

3、過(guò)氧化氫(H2O2)建立氧化損傷成骨細(xì)胞模型，明確了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的保護(hù)作用;通過(guò)觀(guān)察仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞中FoxO1通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，初步明確了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制;同時(shí)，應(yīng)用LC-Q-TOF/MS的方法鑒定了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，解釋了仙茅苷較低生物利用度的代謝機(jī)制，并觀(guān)察了主要代謝產(chǎn)物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用，以探索仙茅苷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　1、仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞功能和

4、抗氧化體系的影響
　　采用H2O2氧化損傷成骨細(xì)胞模型，以細(xì)胞活力、堿性磷酸酶(ALP)酶活力、骨結(jié)節(jié)礦化量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)酶活力、ROS水平、細(xì)胞周期和線(xiàn)粒體膜電勢(shì)為指標(biāo)，考察仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，仙茅苷（10-8、10-7和10-6mol/L）能夠顯著提高氧化損傷成骨細(xì)胞的細(xì)胞細(xì)胞活力、提高ALP酶活力、促進(jìn)骨結(jié)節(jié)的礦化，提高SOD和CAT酶活力、降低ROS水平，提高線(xiàn)

5、粒體膜電勢(shì)和減少細(xì)胞周期阻滯。
　　2、仙茅苷保護(hù)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制研究
　　本實(shí)驗(yàn)采用H2O2氧化損傷成骨細(xì)胞模型，從蛋白水平研究了仙茅苷對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。Westem結(jié)果表明，仙茅苷能夠上調(diào)總蛋白中FoxO1a、sod和OPG的表達(dá)并下調(diào)Rank1的表達(dá);通過(guò)分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白，發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠有效提高FoxO1a蛋白在細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)蛋白的比例，且SOD蛋白表達(dá)同時(shí)上調(diào)。熒光免疫組織化學(xué)定位實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果表明，仙茅苷能夠顯著提高FoxO1a細(xì)胞核在蛋白量，繼而促進(jìn)細(xì)胞核中FoxO1a與ATF4因子的相互作用。
　　3、仙茅苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究
　　建立LC-Q-TOF/MS檢測(cè)仙茅苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，確定了仙茅苷在大鼠體內(nèi)的7個(gè)代謝產(chǎn)物，其中M1、M2和M3為Ⅰ相代謝產(chǎn)物，由仙茅苷糖苷鍵水解或者酯鍵水解而成;M4、M5、M6和M7為仙茅苷在大鼠體內(nèi)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，由仙茅苷、M1和M2葡萄糖醛酸化以及去甲基化

7、而成。Ⅰ代謝相產(chǎn)物分布于血漿、尿液和組織中，而Ⅱ相葡萄糖醛酸接合產(chǎn)物分布在血漿和膽汁中。
　　4、仙茅苷和代謝產(chǎn)物M2藥物含量的分析
　　通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)代謝物M2相對(duì)含量最高且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他代謝產(chǎn)物，經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物M2的血藥濃度遠(yuǎn)高于仙茅苷。另外，M2在重要的組織如腎、骨髓、胸腺、子宮、睪丸和大腦組織中均有分布且含量較高，推測(cè)代謝產(chǎn)物M2可能具有活性。
　　5、代謝產(chǎn)物M2對(duì)氧化損傷成骨細(xì)胞的作用
　　通過(guò)