CGRP對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的調(diào)控作用和機(jī)制研究.pdf

1、牙周?。≒eriodontal disease）是指發(fā)生在牙周支持組織的疾病。牙周組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)）在機(jī)體內(nèi)外因素等影響下發(fā)生的改變，例如：牙槽骨破壞性吸收，牙周膜充血、水腫、溶解、蛻變，牙骨質(zhì)沉積受阻，牙齒松動(dòng)，真性牙周袋形成，牙齦炎癥、增生、萎縮等統(tǒng)稱為牙周病。其中牙槽骨按解剖部份分為固有牙槽骨、密質(zhì)骨、松質(zhì)骨。
　　牙槽骨的破壞性吸收是由于骨重建過程中牙槽骨病理或（和）生理的不平衡引起，是牙周病的主要特

2、征之一。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量和比例決定骨組織的重建；同時(shí)，炎癥因子、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生命周期性調(diào)節(jié)等都在骨組織重建過程中起著相當(dāng)重要的作用。在眾多炎癥因子中腫瘤壞死因子就是其中研究的較詳盡的一組。腫瘤壞死因子家族成員中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的是腫瘤壞死因子，它參與多種細(xì)胞的凋亡調(diào)控。在局部病損的組織內(nèi)有高濃度的腫瘤壞死因子-α聚集，TNF-α及其受體在骨吸收過程中起著重要的作用，影響細(xì)胞凋亡

3、。
　　牙周炎發(fā)生、進(jìn)展、代謝的整個(gè)過程均有成骨細(xì)胞參與。牙菌斑（dental plaque）是牙周炎的始動(dòng)因素。齦上菌斑和齦下菌斑包含大量的致病菌，其中革蘭氏陰性厭氧菌是侵蝕性最強(qiáng)的一類。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的主要成分是脂多糖（LPS），具有破壞牙槽骨組織、促使牙周炎發(fā)展和惡化的作用。LPS可直接作用于牙周靶細(xì)胞，抑制牙周靶細(xì)胞的增殖和分化，加速牙周組織的吸收。鑒于上述原因，脂多糖在增加牙周炎發(fā)病率和促進(jìn)牙槽骨吸收這一方面

4、的特性也成為牙周病病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí)，脂多糖和牙周炎病原體的代謝產(chǎn)物可以影響骨基質(zhì)的形成和細(xì)胞凋亡，在這一過程中，成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)尤其重要。牙槽骨的吸收或者骨質(zhì)疏松是由于脂多糖引起的炎癥反應(yīng)和成骨細(xì)胞凋亡異常，從而導(dǎo)致骨吸收和骨形成之間的紊亂引起。現(xiàn)階段尚無有效治療由LPS誘導(dǎo)的骨破壞的藥物。預(yù)防牙槽骨吸收和骨質(zhì)流失的主要目的是探討成骨細(xì)胞的保護(hù)功能和活動(dòng)的不平衡狀態(tài)，尋找潛在的藥物治療靶點(diǎn)。
　　降鈣素相關(guān)基因肽（C

5、GRP）是1971年首次從甲狀腺髓樣癌組織中提取的蛋白。CGRP由37個(gè)氨基酸組成，包括a-cgrp及b-cgrp兩個(gè)異構(gòu)體，最初是在感覺神經(jīng)末梢被發(fā)現(xiàn)，以分泌顆粒的形式儲(chǔ)存。隨著研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)它存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在骨組織、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等組織中均有CGRP的分布。CGRP在各種組織中呈現(xiàn)出多元生理學(xué)效應(yīng)，還可控制相關(guān)的免疫應(yīng)答。骨組織中CGRP的來源不僅僅是由感覺神經(jīng)纖維末梢分泌，而且可以由成骨細(xì)胞以自

6、分泌和旁分泌的形式生成，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CGRP可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化、增加細(xì)胞體積，同時(shí)在成骨細(xì)胞的表面發(fā)現(xiàn)有CGRP受體的存在。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP作為神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的交叉點(diǎn)，在炎癥中還具有潛在的調(diào)節(jié)作用，它不僅能夠直接通過影響CD4+Thelper細(xì)胞，也可以通過影響抗原遞呈細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。此外，CGRP還能夠有效的抑制單核巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞釋放炎癥因子如TNF-α，IL-1β和CCl4。大量研究提示，讓我們比

7、較確定的是，CGRP作為一個(gè)潛在炎癥調(diào)控者，可以抑制促炎因子的釋放，且在炎癥過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但是對(duì)于LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制，還不是十分清楚。
　　在本次研究中，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察到牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Pg-LPS）可以抑制成骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡；外源性地加入CGRP后，可以減弱這一作用。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討 Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的損傷作用以及 CGRP對(duì)這一過程的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討炎癥因子的調(diào)節(jié)機(jī)

8、制，為牙周病的病因?qū)W研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。ㄒ唬┏晒羌?xì)胞的原代培養(yǎng):選新生小鼠顱骨采用組織塊培養(yǎng)法獲取細(xì)胞。組織塊消化后棄上清，收集組織塊和游出的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基，放致5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。
　?。ǘ┘?xì)胞傳代培養(yǎng):待細(xì)胞消化到開始收縮脫壁后轉(zhuǎn)移致新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所采用的成骨細(xì)胞均是傳至第3-4代的。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前均用無血清的培養(yǎng)液替換之前的含血清的培養(yǎng)液。孵箱中再繼續(xù)培養(yǎng)成骨細(xì)胞24

9、小時(shí)，其目的是使實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處在G0期。
　?。ㄈ┏晒羌?xì)胞鑒定實(shí)驗(yàn):組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞都經(jīng)相差顯微鏡行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察鑒定后再用堿性磷酸酶（ ALP）染色法鑒定，再行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　?。ㄋ模㏄g-LPS抑制成骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡
　　1、Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)研究：實(shí)驗(yàn)一：以濃度分別為0、25、50、100、500、1000ng/mLPg-LPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作用48h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)二：用濃

10、度為500ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)：0、6、12、24、48、72h后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。兩組均采用CCK8法檢測(cè)Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的活性影響。
　　2、Pg-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究：該實(shí)驗(yàn)的分組情況同上述CCK8實(shí)驗(yàn)。用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒檢測(cè)Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　（五）CGRP對(duì)Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性及誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控作用

11、　　1、Pg-LPS對(duì)CGRP表達(dá)的影響： Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞后分別于0、6、12、24、48h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞CGRP含量的影響。
　　2、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響：外源性地加入濃度0、1、10、100、1000nM的 CGRP，對(duì)同一濃度（500ng/ml）Pg-LPS作用后的成骨細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。用CCK8法檢測(cè)CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞的活性影響。
　　3

12、、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響：實(shí)驗(yàn)共4組：對(duì)照組、Pg-LPS組、CGRP組、CGRP+Pg-LPS組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞的凋亡影響。
　　4、凋亡因子檢測(cè)CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞活性的調(diào)控：上述細(xì)胞共培養(yǎng)48h后進(jìn)行選用Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase3抗體，運(yùn)用蛋白免疫印跡

13、法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白。
　　（六）CGRP對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程中TNF-?的表達(dá)影響
　　1、Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞炎癥因子的影響：在成骨細(xì)胞中加入500 ng/mL Pg-LPS后于0、6、12、24、48h時(shí)終止細(xì)胞培養(yǎng)，用炎癥因子試劑盒檢測(cè)上清液中 Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞炎癥因子（TNF-?、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的影響。
　　2、CGRP對(duì) Pg-LPS作用下的成骨細(xì)胞炎癥因

14、子的影響：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Pg-LPS、CGRP、Pg-LPS+CGRP3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中 Pg-LPS+CGRP組成骨細(xì)胞先用100 nM CGRP作用30min后在加入500 ng/mL Pg-LPS作用48h后終止培養(yǎng)，用炎癥因子試劑盒檢測(cè)上清液中 CGRP對(duì) Pg-LPS作用下的成骨細(xì)胞炎癥因子（TNF-?、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的影響。
　　3、CGRP對(duì) Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞腫瘤壞死因子的影

15、響：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)CGRP對(duì)Pg-LPS作用下的成骨細(xì)胞后TNF-α的影響。
　　（七）TNF-α在Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性及誘導(dǎo)凋亡中的作用
　　1、TNF-α及CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞的活性的影響：實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α，分別作用于成骨細(xì)胞后用CCK8法檢測(cè)對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響。

16、
　　2、TNF-α及CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞凋亡的影響：實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α，分別作用于成骨細(xì)胞后用 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　3、凋亡因子檢測(cè)TNF-α及CGRP對(duì)Pg-LPS作用下成骨細(xì)胞的活性的影響：實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS實(shí)驗(yàn)組，收集細(xì)胞后運(yùn)用Cleaved-Caspas

17、e8、Cleaved-Caspase3抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)TNF-α的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┰晒羌?xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。小鼠顱骨的細(xì)小組織塊培養(yǎng)24h后，鏡下觀察：組織塊附近可觀察到少數(shù)細(xì)胞游出；繼續(xù)培養(yǎng)24h后鏡下觀察：已有部分細(xì)胞開始貼壁，且周圍發(fā)亮，顯示其具有活性。以組織塊為中心，細(xì)胞分布密集處呈鋪路石狀，胞體膨大，部分細(xì)胞胞漿豐富，胞漿伸長(zhǎng)，核偏位，突起細(xì)長(zhǎng)呈平行樣或相嵌狀排列。細(xì)胞形狀不規(guī)則，多呈三

18、角形及多角形，也有長(zhǎng)梭形。
　?。ǘ〢LP法鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞。采用堿性磷酸酶（ALP）染色所培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)的染色細(xì)胞，呈塊狀或灰黑色顆粒狀沉淀，胞質(zhì)為陽性反應(yīng)。
　?。ㄈ㏄g-LPS抑制成骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡
　　1、Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響：用不同濃度的 Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞并在48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Pg-LPS在濃度為50 ng/mL時(shí)活性開始降低，并且在濃度為100 ng/mL、5

19、00 ng/mL、1000 ng/mL時(shí)顯著降低了成骨細(xì)胞的活性；用濃度500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細(xì)胞后，在0、6、12、24、48、72h這6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集成骨細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著作用時(shí)間的遞增，成骨細(xì)胞的活動(dòng)明顯降低。
　　2、Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響：不同濃度的Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞并在48h時(shí)檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)Pg-LPS濃度在50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/m

20、L、1000 ng/mL時(shí)成骨細(xì)胞凋亡率明顯遞增，濃度在達(dá)到500 ng/mL后遞增的趨勢(shì)減緩趨于平衡；用濃度為500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細(xì)胞后在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的凋亡率隨著作用時(shí)間的增加呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)，細(xì)胞凋亡率與Pg-LPS處理的時(shí)間呈正相關(guān)性，并且在48h時(shí)趨于平衡。
　?。ㄋ模〤GRP對(duì)Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用
　　1、Pg-LPS對(duì) C

21、GRP的調(diào)控：Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞后分別于0、6、12、24、48收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后對(duì) CGRP含量數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示：CGRP的表達(dá)在6h時(shí)出現(xiàn)短暫升高，此后，蛋白質(zhì)含量逐漸降低，并且隨著作用時(shí)間的遞增，CGRP含量明顯下降。
　　2、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的活性抑制：用不同濃度的CGRP對(duì)相同濃度（500ng/ml）Pg- LPS作用下的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：CGRP對(duì)Pg-LPS有一定的調(diào)控作用，

22、當(dāng)CGRP的濃度為100nM時(shí)，CGRP能顯著減輕Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞活性的抑制。
　　3、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)：本實(shí)驗(yàn)用對(duì)照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS共四個(gè)組分別處理成骨細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示100nM的CGRP能夠顯著減弱Pg-LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的凋亡率。這一結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。
　　4、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的活性的抑制：本實(shí)

23、驗(yàn)用對(duì)照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS四組，作用于成骨細(xì)胞后，運(yùn)用Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase3抗體檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的活性的抑制。
　　（五）CGRP對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程中TNF-?的表達(dá)影響
　　1、Pg-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分別在0、6、12、24、48h5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測(cè)TNF-α、I

24、L-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較Pg-LPS促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-2的表達(dá)，并且呈時(shí)間依賴性表達(dá)。
　　2、CGRP抑制Pg-LPS對(duì)的成骨細(xì)胞炎癥因子的誘導(dǎo)：本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞后，細(xì)胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的表達(dá)。結(jié)果顯示：相同濃度的CGRP

25、作用后只有對(duì)TNF-α的生成具有顯著的變化，而對(duì)IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2沒有明顯變化。
　　3、CGRP抑制Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞TNF-α的誘導(dǎo)：實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨細(xì)胞后細(xì)胞炎癥因子 TNF-α表達(dá)。結(jié)果顯示：CGRP抑制Pg-LPS對(duì)的成骨細(xì)胞TNF-α的誘導(dǎo)。
　　（六）TNF-α在Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性及誘導(dǎo)凋亡中的作用
　　1、TN

26、F-α及CGRP作用于Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的活性影響：實(shí)驗(yàn)分別用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨細(xì)胞后檢測(cè)成骨細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示：CGRP能夠減弱 Pg-LPS作用下對(duì)成骨細(xì)胞的活性抑制，但在有 TNF-?存在的情況下，卻無法產(chǎn)生抑制作用。可見，TNF-?在Pg-LPS抑制的成骨細(xì)胞活性起著一定的作用。
　　2、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡影響：實(shí)驗(yàn)分

27、別用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨細(xì)胞后檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示：CGRP能夠緩解 Pg-LPS作用下細(xì)胞的凋亡，但在有 TNF-?存在的情況下，卻無法產(chǎn)生這種誘導(dǎo)作用。這一結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。
　　3、CGRP減弱Pg-LPS對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡的調(diào)控：本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性表達(dá)。結(jié)果顯示：CGRP能抑制Pg-LPS導(dǎo)致的Cleaved-Caspase8、Cleaved-

28、Caspase3蛋白水平的上調(diào)，卻無法抑制 TNF-?、CGRP、Pg-LPS共培養(yǎng)所上調(diào)的 Cleaved-Caspase8和Cleaved-Caspase3的表達(dá)。表明：CGRP可以抑制Pg-LPS誘發(fā)的凋亡，但這種現(xiàn)象卻被TNF-?反轉(zhuǎn)了；推測(cè)TNF-?很可能就在CGRP抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡作用中扮演著起逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.Pg-LPS抑制成骨細(xì)胞活性及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。
　　2.CGR