AAV9-IGF1對(duì)SOD1G93A小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元閾電位的影響.pdf

1、目前已識(shí)別了超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1)基因100多種突變，占家族型ALS患者的~20％。人SOD1鼠模型的臨床表型及病理基礎(chǔ)與ALS散發(fā)性及家族性患者最為相近。其中，有三種SOD1G85R、SOD1G37R及SOD1G93A已被廣泛的應(yīng)用于ALS的轉(zhuǎn)基因鼠模型。
　　SOD1是表達(dá)153個(gè)氨基酸多肽的同型二聚體酶，每個(gè)亞單元結(jié)合一個(gè)銅及一個(gè)鋅離子。銅負(fù)責(zé)酶的催化活性，鋅負(fù)責(zé)穩(wěn)定蛋白的結(jié)

2、構(gòu)。SOD1的主要功能包括自由基的清除，通過(guò)催化超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化成分子氧和過(guò)氧化氫，通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及過(guò)氧化氫酶分解成水。SOD1分布廣泛，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，線粒體及其他亞細(xì)胞器中也能被檢測(cè)到。
　　腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是一種小的，無(wú)包膜病毒，已經(jīng)成為基因治療領(lǐng)域研究的主題。它介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是安全有效的，也是作為臨床研究的一種治療工具。大量的動(dòng)物模型顯著的證據(jù)表明了重組腺相關(guān)

3、病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAVs）的有效性及安全性。其中，將攜帶編碼人胰島素生長(zhǎng)因子1基因重組腺相關(guān)病毒（insulin like growth factor1 delivery by recombinant adeno-associated virus，rAAV-IGF1）注射到SOD1G93A模型小鼠的呼吸及后肢肌肉中，這延長(zhǎng)了生存期及延緩了運(yùn)動(dòng)的削減。AAV帶菌者具有逆向傳遞的

4、特性，如脊髓神經(jīng)元是選擇性的靶組織，允許局部分泌的人胰島素生長(zhǎng)因子1（insulin like growth factor1，IGF1）對(duì)周圍細(xì)胞有廣泛的作用，并不僅僅局限于傳遞病毒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AAV研究最多的血清型是1,2,5,8,9,及重組。血清型的效果取決于腦分布、物種及靶細(xì)胞類型。這些血清型有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)給神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)受限，使用特定細(xì)胞激活子能夠得到改善。研究證實(shí)，腺相關(guān)病

5、毒血清型9（adeno-associated virus9，AAV9）能通過(guò)血腦屏障且有效靶向腦及脊髓中的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。小鼠中，AAV9介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)小腦延髓池途徑的靶向基因傳遞，與其它AAV血清型相比， AAV9是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞更好的載體，能更好的透過(guò)血腦屏障。
　　為了探究肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）癥狀前期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元電生理的改變及IGF1對(duì)電生理

6、的影響，本實(shí)驗(yàn)采用側(cè)腦室及腦實(shí)質(zhì)兩種方法注射 AAV9-IGF1及 AAV9-GFP（green fluorescent protein，GFP）于SOD1G93A新生鼠中，觀察運(yùn)動(dòng)皮層M2區(qū)的表達(dá)情況，選用IGF1表達(dá)量多的方法注射AAV9-IGF/AAV-GFP，并記錄20-40天SOD1G93A小鼠運(yùn)動(dòng)皮層2區(qū)（motor cortex2 area，M2）的動(dòng)作電位，分析AAV9-IGF1對(duì)SOD1G93A小鼠癥狀前期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)?/p>

7、作電位的影響。
　　目的：
　　1記錄SOD1G93A轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因小鼠的動(dòng)作電位，并比較動(dòng)作電位的閾電位、頻率、動(dòng)作電位幅度、潛伏期及上升速率是否存在差別；
　　2通過(guò)側(cè)腦室及腦實(shí)質(zhì)注射AAV9-IGF1/AAV-GFP于SOD1G93A新生鼠（出生24h內(nèi)）中，分別觀察其在運(yùn)動(dòng)皮層M2區(qū)的表達(dá)效果；
　　3分別記錄腦實(shí)質(zhì)注射AAV9-IGF1/AAV-GFP的20-40天SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠M2區(qū)的動(dòng)

8、作電位，并比較閾電位、頻率、動(dòng)作電位幅度、潛伏期及上升速率是否存在差別。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用C57/6小鼠及SOD1G93A轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照小鼠，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法。采用腦組織及側(cè)腦室兩種方法注射AAV9-IGF1/AAV-GFP，選用20-40天C57/6、SOD1G93A轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠的腦片，用免疫組化及免疫熒光方法觀察AAV9-IGF1及AAV-GFP在運(yùn)動(dòng)皮層M

9、2區(qū)的表達(dá)，選用表達(dá)量多的方法注射AAV9-IGF1/AAV-GFP于SOD1G93A轉(zhuǎn)基因新生鼠中，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄20-40天小鼠腦片M2的動(dòng)作電位，并統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄20-40天 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因（hSOD1G93A）組及非轉(zhuǎn)基因（mSOD1WT）組小鼠腦片運(yùn)動(dòng)皮層M2區(qū)動(dòng)作電位：兩組閾電位有區(qū)別，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組頻率中， SOD1G93A轉(zhuǎn)基因組高于同窩對(duì)

10、照組，150pA電流刺激時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（150pA，P=0.04＜0.05），200-500pA電流刺激時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；動(dòng)作電位幅度，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組上升速率，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因組高于同窩對(duì)照組（450pA除外），250pA電流刺激時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（250pA，P=0.032＜0.05）。
　　2通過(guò)側(cè)腦室及腦實(shí)質(zhì)兩種方法注射AAV9-IGF1/AAV-GFP，應(yīng)用免

11、疫組化及免疫熒光方法觀察20-40天小鼠腦片M2區(qū)IGF1的表達(dá)情況。在小鼠腦片運(yùn)動(dòng)皮層M2區(qū)中，與側(cè)腦室注射相比，腦實(shí)質(zhì)注射的方法IGF1表達(dá)量更高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄腦實(shí)質(zhì)注射AAV9-IGF1/AAV-GFP20-40天SOD1G93A轉(zhuǎn)基因組小鼠腦片M2區(qū)的動(dòng)作電位：與AAV9-GFP組相比，AAV9-IGF1組閾電位明顯減小，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與AAV9-

12、GFP組相比,AAV9-IGF1組動(dòng)作電位幅度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與AAV9-GFP組相比,AAV9-IGF1組動(dòng)作電位的潛伏期縮短，且在150pA、500pA電流刺激時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組上升速率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1與同窩對(duì)照組相比，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠癥狀前期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有興奮性增高的趨勢(shì)。
　　2與側(cè)腦室注射相比，腦實(shí)質(zhì)注射在20-40天小鼠M2區(qū)的IGF1表達(dá)