白藜蘆醇對SOD1-G93A小鼠腰髓和運(yùn)動(dòng)皮層Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一種進(jìn)行性加重的，主要累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（主要包括脊髓、腦干、運(yùn)動(dòng)皮層）的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為逐漸進(jìn)展的肌肉無力、萎縮，感覺系統(tǒng)及括約肌功能一般不受影響。隨著疾病的進(jìn)展，成人常在發(fā)病后3-5年因累及呼吸肌而死亡，目前尚無有效的治療手段。ALS分為兩種類型:散發(fā)型和家族型，散發(fā)型約占所有確診病人的90％-95％，家族型約占5％-10％，

2、其中約20％的家族型ALS已被證實(shí)與Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關(guān)。目前關(guān)于ALS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不是特別明確，亦可能是多種機(jī)制共同參與，其中包括遺傳、氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性作用、線粒體功能障礙、異常蛋白質(zhì)聚集和降解障礙、Ca2+超載、軸索運(yùn)輸障礙、細(xì)胞凋亡等。在前期，我們實(shí)驗(yàn)室詳細(xì)介紹了線粒體功能障礙包括線粒體分裂、融合以及線粒體自噬在ALS發(fā)展過程中變化及作用，但是不管是線粒體分裂、融合、自噬，還是其他各種

3、機(jī)制均有可能通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致ALS疾病發(fā)生和發(fā)展。
　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育所必需的生理過程。機(jī)體在生長發(fā)育過程中，細(xì)胞會新陳代謝，在產(chǎn)生新細(xì)胞同時(shí)，發(fā)生突變或者老化細(xì)胞就可以通過細(xì)胞凋亡機(jī)制而被清除，從而維持機(jī)體正常穩(wěn)態(tài)及功能。細(xì)胞凋亡主要包括三種途徑:死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，而線粒體凋亡途徑是目前研究熱點(diǎn)。Bcl-2家族主要作用位點(diǎn)在線粒體膜上，在線

4、粒體凋亡途徑中起重要作用。Bcl-2家族蛋白分為抗凋亡蛋白以及促凋亡蛋白兩類，其中Bcl-2屬于眾多抗凋亡蛋白中的一種，Bax是促凋亡蛋白的一種，當(dāng)細(xì)胞受到異常信號刺激時(shí)，Bax構(gòu)象發(fā)生變化，從胞質(zhì)易位至線粒體外膜上，形成膜通道結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，從而引起細(xì)胞凋亡。有研究證實(shí)，在阿爾茨海默病(AlzheimerdiseaseAD)、帕金森病(ParkinsondiseasePD)、ALS動(dòng)物模型中，Bax、Bcl-2表達(dá)均發(fā)生了一

5、定的變化。在ALS動(dòng)物模型中，通過抑制Bax基因表達(dá)，影響線粒體凋亡途徑，不僅減少了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失，并且對于改善軸突變性、延長生存期也起到一定作用。白藜蘆醇是二苯基乙烯家族中一類多酚類化合物，在心血管疾病、癌癥、衰老、神經(jīng)退行性疾病等方面具有有益作用。在朊蛋白病動(dòng)物模型中，白藜蘆醇能夠減少促凋亡蛋白Bax易位至線粒體外膜上，阻止細(xì)胞色素C的釋放，保護(hù)神經(jīng)元。那么ALS同樣作為一種神經(jīng)變性病，隨著其疾病進(jìn)展，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、

6、Bax的表達(dá)發(fā)生了怎樣變化？白藜蘆醇對Bcl-2、Bax又產(chǎn)生了怎樣的影響？有待本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
　　SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究ALS最為理想的動(dòng)物模型之一。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同時(shí)期SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中Bax、Bcl-2動(dòng)態(tài)變化情況;以及給予白藜蘆醇處理后小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中兩者表達(dá)情況的變化;進(jìn)一步探討細(xì)胞凋亡在ALS發(fā)病過程中的作用;最后評估應(yīng)用白藜蘆醇對ALS治療可行性。
　　方法:選取S

7、OD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)病程分為癥狀前期（60天）組、癥狀早期(Onset)組、終末期(End)組，選取90d野生型小鼠作為對照組，各組6只;處理組選取70dSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，分為白藜蘆醇組、溶劑組、空白組，每組根據(jù)給藥時(shí)間不同分2個(gè)亞組，每組6只，白藜蘆醇組給予白藜蘆醇乙醇溶液(30mg/kg/d)胃內(nèi)灌注、溶劑組給予同等體積的乙醇溶液胃內(nèi)灌注、空白組不予任何處理，分別連續(xù)灌注至癥狀早期（連續(xù)給藥20-30

8、天）、終末期（連續(xù)給藥50-60天）后取材，以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，處死小鼠，取腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層迅速投入液氮冷凍，之后保存于-80℃冰箱;4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注，之后剝離小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層，用4％多聚甲醛浸泡保存或用2.5％戊二醛固定組織，利用Westernblot技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)觀察SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓與運(yùn)動(dòng)皮層中Bcl-2和Bax的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況及給予白藜蘆醇后SOD1-G

9、93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓與運(yùn)動(dòng)皮層中Bcl-2和Bax的變化情況。并利用spss13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.不同時(shí)期Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中表達(dá)情況
　　(1)Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)情況:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，癥狀早期組和終末期組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Bcl-2表達(dá)量降低，而Bax表達(dá)量升高;與對照組相比，癥狀前期

10、組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Bcl-2和bax表達(dá)量無明顯改變。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標(biāo)記物SMI32共定位情況:與對照組相比，癥狀早期組和終末期組Bcl-2在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量降低，而Bax在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量升高;與對照組相比，癥狀前期組Bcl-2、Bax在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量無明顯變化。
　　(2)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中總的Bcl-2、Bax的含量:與對照組相比，終末期組Bcl-2含量明顯減少，差

11、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癥狀早期組及癥狀前期組Bcl-2含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對照組相比，終末期組和癥狀早期組Bax含量均增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癥狀前期Bax含量無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.給予白藜蘆醇干預(yù)后不同時(shí)期SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層中Bcl-2和Bax表達(dá)情況
　　(1)癥狀早期:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇干預(yù)后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，與空白組相比，

12、白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達(dá)量升高，而運(yùn)動(dòng)皮層中Bax表達(dá)量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax表達(dá)量無明顯變化。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標(biāo)記物SMI32共定位情況:在SOD1-G93A小鼠腰髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達(dá)量升高，而Bax表達(dá)降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量無明顯變化。Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):與空白組相比，

13、在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜蘆醇組與溶劑組Bcl-2含量升高，而Bax含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)終末組:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇干預(yù)后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及運(yùn)動(dòng)皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達(dá)量升高，而運(yùn)動(dòng)皮層中Bax表達(dá)量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax表達(dá)量無

14、明顯變化。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標(biāo)記物SMI32共定位情況:在SOD1-G93A小鼠腰髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達(dá)量升高，而Bax表達(dá)量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量無明顯變化。Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜蘆醇組、溶劑組、空白組三組Bcl-2和Bax含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論: