HDAC4核內(nèi)穿梭在應力調(diào)節(jié)軟骨細胞基因表達中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　關節(jié)軟骨覆蓋在關節(jié)表面，是關節(jié)實現(xiàn)正常功能的重要結構。關節(jié)軟骨的組成成分包括軟骨細胞和細胞外基質(zhì)，細胞外基質(zhì)主要包括膠原和蛋白多糖，而細胞成分只有軟骨細胞一種。軟骨細胞可分泌新基質(zhì)，并降解老化和受損的基質(zhì)，以維持軟骨結構的完整性。負重是關節(jié)軟骨的基本功能，關節(jié)負重首先使關節(jié)軟骨受到直接的壓應力。研究顯示力學應力可調(diào)節(jié)軟骨的基因表達。正常生理應力可促進軟骨表型相關基因的表達和基質(zhì)蛋白分泌。相反，異常的機械應力（如應力過大

2、或喪失）可誘發(fā)或促進軟骨的退變，軟骨退變最終會導致骨關節(jié)炎。雖然大量研究都證實力學應力和軟骨有密切的關系，但是力學傳導的機制，即軟骨細胞如何感應和傳導力學信號，仍然不明了。組蛋白去乙?；?（HDAC4）特異性地分布在腦組織、心肌組織、骨骼肌肉和軟骨組織中。敲除HDAC4的基因鼠表現(xiàn)為軟骨細胞早期、異常的肥大，和異位骨化，最終在出生前后死亡。HDAC4有一奇特能力，可在細胞核和細胞漿之間穿梭。已有的研究顯示，HDAC4在細胞核內(nèi)外的穿梭

3、對肌肉細胞分化，神經(jīng)細胞功能的發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們實驗室以往的研究顯示，HDAC4細胞核內(nèi)外的穿梭在生長板骺軟骨細胞的分化中起決定性的調(diào)節(jié)作用。但還不清楚，機械應力是否能誘導HDAC4核內(nèi)外移動。本研究旨在觀察壓應力對HDAC4細胞核內(nèi)外移動的影響，及HDAC4細胞核內(nèi)外的移動在力學調(diào)節(jié)軟骨細胞基因表達中的作用。
　　目的：
　?。?）應用Flexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加

4、壓應力，觀察壓應力對軟骨細胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外移動的影響。
　?。?）應用Flexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力，分析壓應力引起的HDAC4核內(nèi)外移動對軟骨細胞基因表達的影響，探討HDAC4核內(nèi)外移動在壓應力調(diào)節(jié)軟骨細胞基因表達中的作用。
　?。?）應用Flexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)和軟骨細胞體外立體培養(yǎng)，探討壓應力誘導HDAC4核內(nèi)外移動的機制，及HDAC4

5、核內(nèi)外移動調(diào)節(jié)軟骨細胞基因表達的機制。
　　方法：
　　本課題包括以下五方面研究：
　?。?）軟骨細胞立體培養(yǎng)及壓應力作用時間的選擇。包括以下幾方面內(nèi)容：
　?、?天齡幼鼠（C57Bl/6）軟骨細胞的分離和體外培養(yǎng)；
　?、诰G色熒光蛋白（GFP）標記的HDAC4（GFP-HDAC4）腺病毒載體的體外擴增和轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的鼠軟骨細胞；
　　③將轉(zhuǎn)染GFP-HDAC4的軟骨細胞移至2％藻酸鹽水凝膠中，繼續(xù)立

6、體培養(yǎng)；
　?、軕肍lexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力，觀察不同作用時間對基因表達的影響，以選擇最佳的負載時間。
　　（2）觀察壓應力對軟骨細胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外分布的影響。主要實驗內(nèi)容如下：
　　①應用Flexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加最佳負載時間的壓應力，應用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外分布的變化；<

7、br>　?、趯κ芰筌浌羌毎募毎麧{蛋白和細胞核蛋白進行分離提取，應用west-blot分析細胞漿內(nèi)HDAC4和細胞核內(nèi)HDAC4含量在壓應力作用前后的變化。
　　（3）觀察壓應力對軟骨細胞代謝、增殖及分化的影響。具體實驗內(nèi)容如下：
　?、賾肦T-PCR檢測軟骨細胞受到壓應力后蛋白聚糖、II型膠原、LK1、SOX9、CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ihh和 Runx2基因表達的變化；
　?、趹肧afranin

8、-O染色評價壓應力對軟骨細胞分泌蛋白多糖的影響，應用west-blot評價壓應力對軟骨細胞分泌II型膠原的影響；
　　③應用EdU細胞增殖檢測法評價應力對軟骨細胞增殖的影響；
　　④進一步行I型膠原和II型膠原免疫組織化學染色，評價應力對軟骨細胞分化的作用。
　?。?）探討壓應力誘導HDAC4細胞核內(nèi)外再分布的機制。實驗內(nèi)容有：
　?、偈紫?，應用免疫共沉淀和west-blot檢測壓應力對軟骨細胞內(nèi)HDAC4磷酸化

9、的影響；
　?、谌缓?，應用蛋白磷酸酶2A（PP2A）免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒觀察壓應力對PP2A活性的影響。
　?。?）應用PP2A抑制劑，岡田酸（Okadaic acid，OA），進一步證實壓應力促進HDAC4細胞核內(nèi)外移動是通過PP2A去磷酸化HDAC4途徑來調(diào)控的。
　　又分以下幾個實驗：
　?、衮炞CPP2A抑制劑，OA，阻止壓應力誘導的HDAC4細胞核內(nèi)移。應用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)

10、外分布的變化，分離提取受力后軟骨細胞的細胞漿蛋白和細胞核蛋白，應用west-blot分析細胞漿HDAC4和細胞核HDAC4含量在壓應力作用后的變化；
　?、谧C實是否OA抑制壓應力誘導的HDAC4去磷酸化。應用HDAC4抗體對分離的軟骨細胞核、漿蛋白進行免疫共沉淀，之后應用抗磷酸化絲氨酸的抗體進行west-blot檢測磷酸化的HDAC4。
　?、蹜肞P2A免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒，檢測OA是否抑制PP2A活性；
　?、?/p>

11、應用RT-PCR觀察OA是否抑制壓應力誘導的軟骨細胞基因表達變化；
　?、輵肏oechst33342/Propidium Iodide（PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒，觀察OA是否誘導軟骨細胞死亡。
　　結果：
　?。?）軟骨細胞立體培養(yǎng)及壓應力最佳作用時間。
　　①鼠軟骨細胞分離和體外培養(yǎng)成功；
　?、诤珿FP-HDAC4腺病毒載體的體外擴增成功，并可對體外培養(yǎng)鼠軟骨細胞高效轉(zhuǎn)染；
　　③轉(zhuǎn)染GFP

12、-HDAC4的軟骨細胞在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)生長良好，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)一周，軟骨細胞GFP-HDAC4的表達率約89.8%（86.9%～92.6%）；
　?、軕肍lexcell? FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力：0.5Hz正弦波形變化，0～20kPa壓應力強度變化（0.5Hz，20kPa），施壓2小時和3小時時間點蛋白多糖和II型膠原的mRNA表達都

13、明顯增加（p<0.05），但施壓4小時后mRNA表達較3小時時間點減少（p<0.05），因此選擇3小時壓應力（0.5Hz，20kPa）作為負載條件。
　?。?）壓應力促進HDAC4進入軟骨細胞核。
　?、偌す夤簿劢癸@微鏡觀察顯示，在未受力的立體培養(yǎng)軟骨細胞中，HDAC4主要分布在細胞漿；而在受到3個小時壓應力的軟骨細胞中，HDAC4主要分布在細胞核。比較HDAC4主要分布在細胞核內(nèi)的細胞數(shù)，受應力組明顯高于未受應力組（P=0

14、.009）。
　?、诿庖吖渤恋韺嶒炦M一步證實，細胞漿內(nèi)HDAC4蛋白含量，未受力組明顯高于受力組；而細胞核內(nèi)的HDAC4蛋白含量，受力組明顯高于未受力組。這些實驗證實，壓應力誘導HDAC4從細胞漿移動到細胞核。
　?。?）壓應力調(diào)節(jié)軟骨細胞基因表達。
　?、賀T-PCR檢測顯示，軟骨細胞受到壓應力后蛋白聚糖、II型膠原、LK1和SOX9的mRNA表達顯著升高（p<0.05），而CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ih

15、h和 Runx2的mRNA表達顯著降低（p<0.05）；
　?、赟afranin-O染色顯示，壓應力組軟骨細胞周圍的紅染程度比對照組顯著深；west-blot檢測顯示，壓應力組的II型膠原蛋白量明顯高于對照組；
　?、跡dU檢測顯示，壓應力組細胞的陽性率明顯高于對照組（P=0.0047）；
　?、苊庖呓M織化學染色顯示，壓應力組細胞的II型膠原染色陽性，I型膠原染色陰性。以上結果證實壓應力促進軟骨細胞的代謝和增殖，并抑制

16、其分化。
　　（4）壓應力使HDAC4去磷酸化，并增加PP2A活性。
　?、倜庖吖渤恋砗蛍est-blot檢測顯示，壓應力可使軟骨細胞內(nèi)HDAC4去磷酸化；
　?、赑P2A免疫沉淀磷酸酶檢測顯示，壓應力可增加PP2A活性。
　?。?）岡田酸（Okadaic acid，OA）抑制實驗。
　?、貽A阻止壓應力誘導的HDAC4細胞核內(nèi)移。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，添加抑制劑OA后，軟骨細胞受到壓應力，HDAC4仍

17、然主要分布在細胞漿。West-blot分析顯示，添加抑制劑OA后，軟骨細胞即使受到壓應力，細胞漿和細胞核內(nèi)的HDAC4含量與未受壓應力的對照組相比變化也不明顯；
　?、诿庖吖渤恋砗蛍est-blot檢測證實，加抑制劑OA后壓應力不能使HDAC4去磷酸化；
　?、跴P2A免疫沉淀磷酸酶檢測顯示，加OA后壓應力不能增加PP2A活性；
　?、躌T-PCR檢測顯示，與壓應力組比較，OA+壓應力組中蛋白聚糖、II型膠原、LK1和

18、SOX9的mRNA表達顯著降低（p<0.05），而CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ihh和 Runx2的mRNA表達顯著增高（p<0.05）；
　?、輵肏oechst33342/Propidium Iodide(PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒觀察顯示，OA不誘導軟骨細胞死亡。
　　結論：
　　本實驗首次發(fā)現(xiàn)：
　　①壓應力可促進HDAC4由細胞漿進入細胞核；
　　②HDAC4進入細胞核后，可調(diào)節(jié)軟骨細