周期性張應(yīng)力對大鼠生長板軟骨細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.研究大鼠生長板軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)和共培養(yǎng)，并探討兩者作為組織工程種子細(xì)胞的優(yōu)缺點。
　　2.研究周期性張應(yīng)力對大鼠生長板軟骨細(xì)胞增殖的影響及ERK和YAP蛋白的作用。
　　3.觀察FAK、細(xì)胞骨架F-actin和RhoA通路在周期性張應(yīng)力對大鼠生長板軟骨細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)中的作用。
　　方法：
　　1.分別取大鼠生長板軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。骨髓間充

2、質(zhì)干細(xì)胞行三系分化誘導(dǎo)并檢測分化能力。將細(xì)胞行3D培養(yǎng)和共培養(yǎng)，實驗分三組：生長板軟骨細(xì)胞單獨培養(yǎng)組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組。Real-time PCR檢測三組細(xì)胞成軟骨分化基因的表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法檢測細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)情況。
　　2.采用四點彎曲張力儀，對體外培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細(xì)胞行周期性張應(yīng)力，Western Blot檢測YAP和ERK蛋白的活化及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)，Real-t

3、ime PCR檢測C-Fos和CTGF基因的表達(dá)。阻斷細(xì)胞ERK或YAP蛋白的活性，Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測力學(xué)刺激對細(xì)胞增殖作用的改變。
　　3.對大鼠生長板軟骨細(xì)胞行周期性張應(yīng)力，Western Blot檢測FAK和RhoA蛋白的表達(dá)。免疫熒光觀察應(yīng)力對細(xì)胞骨架F-actin的作用。阻斷細(xì)胞FAK或RhoA活性，以及抑制細(xì)胞骨架F-actin聚集，Western Blot檢測張應(yīng)力對YAP和ERK蛋白表達(dá)的變化

4、。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠生長板軟骨細(xì)胞呈三角形或短梭形，而大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈長梭形。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有三系分化的能力。盡管早期共培養(yǎng)組成軟骨分化能力要強(qiáng)于其他兩組，但后期大鼠生長板軟骨細(xì)胞單獨培養(yǎng)組的成軟骨分化能力最強(qiáng)。
　　2.大鼠生長板軟骨細(xì)胞在受到3000μstrain、0.5Hz的張應(yīng)力刺激1h時，YAP和ERK蛋白的活性最高，C-Fos和CTGF基因mRNA表達(dá)水平也最高。適宜的力學(xué)刺激能促進(jìn)細(xì)胞增

5、殖，改變細(xì)胞周期，并且抑制YAP和ERK的活性可阻斷該作用。
　　3.周期性張應(yīng)力能促進(jìn)大鼠生長板軟骨細(xì)胞FAK和RhoA蛋白的活化，以及細(xì)胞骨架F-actin聚集。給予細(xì)胞PF573228、C3toxin以及細(xì)胞骨架松弛素D，可阻斷應(yīng)力活化YAP和ERK蛋白。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠生長板軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞各自有優(yōu)缺點，3D培養(yǎng)和共培養(yǎng)有益于生長板組織工程的發(fā)展。
　　2.周期性