膽汁內(nèi)、外引流術對梗阻性黃疸大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2蛋白及基因表達的影響.pdf

1、梗阻性黃疸（Obstructive jaundice，OJ）是臨床常見疾病，多由肝內(nèi)或肝外膽管機械性梗阻導致膽汁排出不暢和膽汁淤積所致，其伴隨和誘發(fā)的高膽紅素血癥、內(nèi)毒素血癥、菌血癥及氧化應激狀態(tài)的改變等對肝屏障、腸道屏障等機體各臟器功能的影響，一直是近年來關注的熱點。雖然梗阻性黃疸肝損傷的研究已取得很大進步，但仍有很多損傷機制尚未完全清楚，仍需進一步研究以求更大的突破及發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)代研究逐漸認識到肝內(nèi)膽管在正常情況下能特異性表達黏蛋白（M

2、ucins，MUC），對維持肝屏障的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管中MUC的異常表達及分布改變?yōu)槟懙兰膊〉陌l(fā)生發(fā)展及預后評估發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管過度分泌的MUC5和MUC2所致的慢性增生性膽管炎是肝內(nèi)膽管結石形成的主要致病因素。其中分泌型黏蛋白MUC2是腸黏液層的主要骨架，參與構成黏膜的保護屏障。大量的O-型寡聚糖鏈提供了較好的黏附功能，同時相鄰聚糖鏈中不同糖基間通過分子內(nèi)共價鍵連接，促使其彈性凝膠的形成。

3、既往對MUC2的研究主要集中于胃腸道，在正常的腸道黏液層中，MUC2對腸屏障發(fā)揮了至關重要的保護作用。多項研究證實梗阻性黃疸時腸黏膜屏障損傷，腸道黏液層受損，可導致MUC2蛋白表達改變，腸黏膜因細菌侵襲而發(fā)生穩(wěn)態(tài)失衡，使得炎癥反應加重。除此之外，在炎癥性膽管疾病中，肝內(nèi)膽管中MUC2異常表達對肝屏障的破壞作用也同樣引起重視。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)有關OJ大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2蛋白及基因表達的研究報道。所以，積極開展OJ大鼠肝屏障損傷與肝內(nèi)膽管

4、中MUC2蛋白及基因表達的實驗研究具有重要臨床意義。
　　目前臨床上對于OJ患者，外科手術仍是主要治療方法，但術后并發(fā)癥及死亡率一直居高不下，多數(shù)學者認為術前需要解除梗阻，但本身操作也會引起并發(fā)癥，因此目前對于外科手術前是否需要解除，一直存在爭議。膽汁內(nèi)外引流術作為臨床上解除膽道梗阻的兩種方法，哪種引流方式更好，迄今尚無統(tǒng)一意見。因此本實驗通過研究膽汁內(nèi)、外引流術對OJ大鼠肝內(nèi)膽管上皮組織MUC2蛋白及基因表達的影響，為OJ患者臨

5、床治療提供更多指導依據(jù)。具體實驗內(nèi)容如下：
　　目的：探討OJ大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2表達與肝屏障損傷的關系，以及膽汁內(nèi)、外引流術對OJ大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2蛋白及基因表達的影響及意義。
　　方法:將36只體重約200-250g的成年健康雄性SD大鼠隨機分成四組:假手術組（sham operation，SH），梗阻性黃疸組（obstructive jaundice， OJ），膽汁內(nèi)引流組（internal drainage，I

6、D）及膽汁外引流組（external drainage，ED）。
　　1.利用改進的造模方法建立動物模型
　　第一次手術:SH組模型（只做十二指腸牽拉，不結扎膽管），OJ組模型（分離膽管并結扎離斷），ID組和ED組模型（操作同OJ組）。
　　第8天行二次手術:SH組模型（只做十二指腸牽拉，不做其他處理）， OJ組模型（可見膨大膽管，只做十二指腸牽拉，不做其他處理），ID組模型（可見膨大膽管，引流管一端插入膽管縫線固定，

7、另一端與十二指腸相通并荷包縫合固定），ED組模型（可見膨大膽管，引流管一端插入膽管縫線固定，另一端經(jīng)皮下引至頸背部縫線固定）。
　　2.留取標本
　　各組大鼠模型均于2次術后第7天取材。應用去致熱原處理的注射器在門靜脈穿刺抽血1ml用于血清內(nèi)毒素測定；留取下腔靜脈血2ml用于血清肝功能檢測。取肝組織數(shù)塊，HE染色觀察肝臟及肝內(nèi)膽管病理形態(tài)學變化；應用免疫組織化學染色法（Immunohistochemistry，IHC）檢測肝

8、內(nèi)膽管中MUC2蛋白表達和分布情況；應用Real time-PCR檢測肝內(nèi)膽管中MUC2 mRNA的表達水平。
　　結果：
　　1.血清肝功能水平
　　通過肝功能檢測發(fā)現(xiàn)OJ組大鼠血清TBIL（107.440±18.150μmol/L）、ALT（122.390±35.310U/L）、AST（409.760±72.500U/L）較 SH組（21.130±3.230μmol/L）、（40.460±9.430U/L）、（89

9、.050±28.840U/L）均明顯升高（*P<0.01）；ID組大鼠血清中TBIL（30.230±11.860μmol/L）、ALT（56.500±19.190U/L）、AST（178.910±66.870U/L）和ED組大鼠TBIL（35.640±11.860μmol/L）、ALT（59.690±19.700U/L）、AST（109.340±37.900U/L）較OJ組均明顯降低（≠P<0.01）；ID組與ED組大鼠血清TBIL、A

10、LT之間無顯著差異（P=0.454；P=0.793），然而ED組大鼠血清AST較ID組明顯降低（＃P<0.05）。
　　2.血清內(nèi)毒素水平
　　OJ組（0.940±0.290EU/ml）大鼠血清內(nèi)毒素水平較 SH組（0.160±0.100EU/ml）明顯升高（*P<0.01）；而ID組（0.230±0.120EU/ml）和 ED組（0.450±0.180EU/ml）較 OJ組血清內(nèi)毒素水平明顯降低（≠P<0.01）；且ID組

11、較ED組血清內(nèi)毒素水平顯著降低（＃P<0.05）。
　　3.HE染色結果
　　SH組：顯示正常的肝小葉結構，匯管區(qū)肝內(nèi)膽管排列整齊。OJ組：肝小葉結構消失，匯管區(qū)肝內(nèi)膽管明顯增生且排列紊亂，伴纖維組織增生及大量炎性細胞浸潤。ID、ED組：與OJ組相比肝小葉結構有所恢復，周圍炎性細胞浸潤減輕，但仍有部分纖維組織及肝內(nèi)膽管增生存在。ED組匯管區(qū)纖維組織及肝內(nèi)膽管增生與炎性細胞浸潤程度較ID組明顯。
　　4.免疫組化結果

12、r>　　MUC2蛋白在OJ組大鼠增生的肝內(nèi)小膽管中表達明顯增強，陽性顆粒分布較廣泛，且染色較深。而SH組大鼠的肝內(nèi)膽管中MUC2蛋白表達較弱，陽性顆粒密度較小，且顯色強度較弱。OJ組MUC2蛋白表達的平均光密度值（OD0.022±0.003）較SH組（OD0.004±0.002）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（*P<0.01）。ID組（OD0.008±0.002）和ED組（OD0.014±0.001）較OJ組均明顯減少（≠P<0.01），

13、而ED組MUC2蛋白表達較ID組增強，且差異具有統(tǒng)計學意義（＃P<0.05）。
　　5.Real time-PCR結果
　　OJ組大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2 mRNA表達（0.390±0.080）較SH組（0.100±0.030）明顯增高，具有顯著性差異（*P<0.01）。ID組（0.170±0.010）和ED組（0.240±0.050）較OJ組均明顯降低（≠P<0.01）。然而ED組大鼠肝內(nèi)膽管中MUC2 mRNA表達較ID組

14、增強，差異具有統(tǒng)計學意義（＃P<0.05）。
　　結論：
　　1.梗阻性黃疸時，存在嚴重的內(nèi)毒素血癥，肝屏障功能嚴重受損，組織學上，大鼠的肝內(nèi)膽管明顯增生且排列紊亂，并伴纖維組織增生及大量炎性細胞浸潤，在肝內(nèi)的小膽管中MUC2蛋白可表達增強，提示MUC2可能參與了梗阻性黃疸大鼠肝屏障損傷的發(fā)病過程。
　　2.通過膽汁內(nèi)、外引流術均可明顯減輕內(nèi)毒素血癥，并不同程度改善肝屏障功能，組織學上，膽汁引流后的大鼠仍有部分纖維組織