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文檔簡介
1、目的:惡性膠質(zhì)細胞瘤(GBM,世界衛(wèi)生組織IV級神經(jīng)膠質(zhì)瘤)在成年人中它是最常見的惡性的原發(fā)性腦腫瘤,它是人類最致命的腫瘤之一。盡管在過去幾十年的治療中不斷取得進展,但本病的治療及預后仍然很差,在美國和歐洲地區(qū)5年生存率平均小于3%。最近的研究已經(jīng)表明,在膠質(zhì)瘤細胞中,存在著膠質(zhì)瘤干細胞(CSCs),膠質(zhì)瘤干細胞能自我分化并不斷的更新增殖成膠質(zhì)瘤細胞,并導致腫瘤不斷增殖生長。本研究目的就是鑒于此理論基礎,從惡性膠質(zhì)細胞瘤中分離表達CD1
2、33的細胞,通過一系列實驗證實其是高度致瘤性,并且有很強的侵襲性和耐化療性。然而,對于維持膠質(zhì)瘤干細胞的分子機制在很大程度上仍然未知。有實驗報道,在維持腫瘤干細胞的干性上,發(fā)現(xiàn)miRNA起到一定的作用,miRNA是一類長度為19~25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié),一般通過靶基因的3’端非翻譯區(qū)部分互補配對的結(jié)合方法來調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄水平。研究表明,Hippo信號通路起著限制器官大小和抑制腫瘤發(fā)生起至關(guān)重要的作用
3、。生物學上表明, Hippo信號通路在很大程度上限制了它的兩個下游效應因子YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影響到Y(jié)AP/TAZ的表達水平。在此,我們通過篩查出miR-130b在膠質(zhì)瘤中的高表達水平,通過過表達miR-130b后來檢測Hippo信號通路中的下游信號基因的表達及活性水平,同時檢測干細胞標志基因,包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表達水平,以觀察 miR-130b對膠質(zhì)瘤干細胞的影響。這些
4、研究為miR-130b在Hippo信號通路中的作用,以及miR-130b在膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)展中的作用提供了一種新的機制,而且為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了一種很好的思路。
方法:為了檢測miR-130b在膠質(zhì)瘤組織及細胞中表達水平,我們收集膠質(zhì)瘤組織標本8例,正常組織3例。正常細胞NHA以及膠質(zhì)瘤細胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。運用BioTNT生物公司miR-130b檢測試劑盒(CL-has-miR-1
5、30b)對標本進行檢測。同時我們檢測了miR-130b對膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細胞成球的作用,將約500個細胞接種在6孔板上以及將約10個細胞接種在24孔板上,用無血清的培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)13天,在培養(yǎng)的過種中加入2%B27,同時加入表皮生長因子20ng/ml,和bFGF20ng/ml,0.4%牛血清白蛋白(BSA)和為5μg/ml的胰島素。進行培養(yǎng)后,然后檢測其成球的大小,算出其倍數(shù)。我們運用WB方法檢測了miR-130b對Hi
6、ppo信號通路中YAP、TAZ蛋白表達的影響,用核蛋白P84抗體作為參照(Sigma美國),同時檢測MST1和SAV1蛋白水平,用α-Tubulin抗體作為內(nèi)參對照(Sigma美國)。用熒光素酶方法檢測miR-130b對TEAD活性的影響,將購買的TEAD質(zhì)粒在48孔板中共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞,每組設置4個復孔,操作按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行,48h后進行熒光素酶檢測。運用miRBASE軟件預測miR-130b與
7、MST1/SAV1的調(diào)控關(guān)系,軟件預測miR-130b與MST1/SAV1都存在調(diào)控位點,運用熒光素酶的方法,檢測miR-130b與基因 MST1/SAV1是否存在調(diào)控作用,我們構(gòu)建了MST1/SAV13’端,同時設計突變位點,共轉(zhuǎn)染細胞進行上機檢測,測定熒光值。
結(jié)果:通過參考癌癥基因GBM miRNA芯片數(shù)據(jù)(TCGA),我們發(fā)現(xiàn)miR-130b水平明顯上調(diào)在人腦膠質(zhì)瘤組織(n=496)與正常腦組織相比(n=10)(P<0
8、.001)。通過RT-PCR檢測進一步驗證了這一結(jié)果。miR-130b水平在8例GBM組織相比,與在3例正常腦組織中顯著增加,并與在5種膠質(zhì)細胞瘤的細胞系相比,在正常的人星形膠質(zhì)細胞(NHA)顯著降低。miR-130b對膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細胞成球的作用,過表達miR-130b有力促進懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生大約兩倍以上的細胞球。相反, mir-130b-抑制細胞形成的球體不及正常球體的2倍,我們的研究結(jié)果表明,miR-130b促進膠質(zhì)細胞瘤成球的
9、作用。WB法檢測蛋白的表達水平得知,過表達miR-130b使YAP、TAZ的表達增高,而抑制miR-130b的表達可以使蛋白YAP、TAZ的表達降低,而核因子P84的表達卻沒有影響,而過表達miR-130b后,MST1和SAV1蛋白水平降低,這說明miR-130b直接影響了Hippo信號通路基因而發(fā)揮相關(guān)功能作用。熒光素酶進一步驗證了在過表達miR-130b的穩(wěn)定細胞株SNB19和LN18中,干擾YAP和TAZ的情況下,與陽性對照的順鉑
10、對比,檢測的熒光值為1、0.25、0.28和1、0.26、0.39,均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
結(jié)論:YAP與TAZ均與TEAD有顯著的作用,其降低TEAD的活性比順鉑還要強。由mirBASE軟件預測miR-130b與MST1/SAV1有調(diào)控位點,通過熒光素酶檢測提示miR-130b與 MST1/SAV1-3'UTR測得的熒光值顯著降低,說明它們之間有結(jié)合點,減弱了熒光的表達,而在對照及正常組中,熒光的值沒有什么變化,
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