釀酒酵母氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)基因缺失菌對于環(huán)境因子基因毒效應(yīng)的響應(yīng)及體內(nèi)增變菌株的構(gòu)建.pdf

1、環(huán)境中的重金屬和紫外線輻射由于對細(xì)胞產(chǎn)生強烈的基因毒效應(yīng)而具有致癌性，有研究表明該毒效應(yīng)與其能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加有關(guān)?；钚匝踔饕侵富顫姷难踝杂苫c具有氧自由基反應(yīng)特性的其它含氧物質(zhì)，對包括DNA分子在內(nèi)的生物大分子具有氧化損傷作用。釀酒酵母細(xì)胞體內(nèi)大致有三條途徑來應(yīng)對胞內(nèi)活性氧導(dǎo)致的DNA損傷，分別為抗氧化途徑、DNA損傷檢驗點途徑和DNA損傷修復(fù)途徑，這三條途徑形成了釀酒酵母氧化損傷修復(fù)體系。其中抗氧化途徑主要作用為清除胞內(nèi)過

2、量的活性氧，維持胞內(nèi)氧化還原平衡；DNA損傷檢驗點途徑主要作用為感受DNA損傷及異常DNA結(jié)構(gòu)的存在，通過延遲細(xì)胞周期的進(jìn)行，使細(xì)胞有足夠的時間增強各種DNA修復(fù)系統(tǒng)的活性，或者在DNA損傷無法修復(fù)的情況下最終引發(fā)細(xì)胞凋亡程序；DNA損傷修復(fù)途徑主要作用為修復(fù)胞內(nèi)DNA的各種損傷。 本論文工作在對重金屬和紫外線脅迫條件下細(xì)胞氧化損傷修復(fù)體系基因缺失菌株突變率進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，對釀酒酵母氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)與環(huán)境因子基因毒效應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)

3、系做了一定探討。同時，嘗試構(gòu)建溫度敏感致突變菌株，以彌補普通致突變菌株篩選后無法保持目的基因穩(wěn)定性的缺陷。本論文的主要工作內(nèi)容和結(jié)果如下： 1．通過測定釀酒酵母氧化損傷修復(fù)體系基因缺失菌在重金屬和紫外線脅迫條件下特定基因座位突變頻率的變化，研究了釀酒酵母氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)與環(huán)境因子基因毒效應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系。 通過測定重金屬和紫外脅迫條件下釀酒酵母氧化損傷修復(fù)體系基因缺失菌can1基因座位的突變頻率，檢測釀酒酵母氧化損傷修復(fù)體系

4、對于重金屬和紫外線基因毒效應(yīng)的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)途徑msh2基因缺失菌以及同源重組修復(fù)途徑rad51基因缺失菌在重金屬脅迫條件下其突變率相對于野生型菌株的升高幅度高于在紫外線處理條件下的突變率升高幅度，說明重金屬處理導(dǎo)致的DNA損傷中DNA錯配突變和DNA鏈斷裂等突變更為嚴(yán)重。而抗氧化途徑tsa1基因缺失菌在重金屬脅迫條件下其突變率相對于野生型菌株的升高幅度也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于紫外線處理條件下突變率的升高幅度，這說明由重金屬引起的釀酒酵母胞

5、內(nèi)活性氧水平增加所導(dǎo)致的DNA氧化損傷在重金屬基因毒效應(yīng)中可能發(fā)揮著更為重要的作用。 2．釀酒酵母溫度敏感致突變菌株的構(gòu)建 利用長側(cè)翼同源區(qū)PCR的方法擴增兩側(cè)同源區(qū)分別為目的基因啟動子和ORF的溫度敏感基因缺失同源重組片段，僅獲得msh2基因的同源重組片段，將含有URA3標(biāo)記的該片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母JD54菌株并使其同源重組至msh2基因的啟動子和ORF之間，將篩選到的正確轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步涂布于5-FOA平板，同源重組去除U