銀杏葉片對(duì)大鼠苯磺酸氨氯地平藥動(dòng)學(xué)的影響以及乙醇抑制離體大鼠胃收縮反應(yīng)的研究.pdf

1、氨氯地平為第三代二氫吡啶類 Ca2+通道阻滯藥，主要通過阻斷“L-型電位動(dòng)作”鈣通道。阻滯血管平滑肌細(xì)胞外的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，松弛平滑肌，降低心肌收縮力、降低頻率和減慢傳導(dǎo)；此外，氨氯地平可通過提高細(xì)胞膜鈣泵活性，從而降低腦漿游離鈣濃度來降低血壓。氨氯地平口服吸收完全，較其他的鈣離子拮抗劑高，但其過程緩慢，在口服后的6~12h才呈現(xiàn)血藥濃度峰值，故氨氯地平具有降壓持續(xù)時(shí)間久、血壓峰谷波動(dòng)較小等特點(diǎn)，可以使氨氯地平具有延遲高血壓發(fā)生并減

2、輕高血壓發(fā)作程度的優(yōu)點(diǎn)。
　　銀杏葉具有藥用價(jià)值，可以有效的預(yù)防和治療高血壓、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，廣泛應(yīng)用于臨床。臨床上常見與其他心腦血管藥物聯(lián)合使用，有報(bào)道稱，銀杏葉滴丸聯(lián)合苯磺酸氨氯地平可以顯著降低老年高血壓患者血漿sDR4、sDR5的水平，改善老年高血壓患者心肌細(xì)胞凋亡。但是從藥代層面評(píng)估銀杏葉對(duì)氨氯地平的影響尚未見報(bào)道。銀杏葉片是否對(duì)其藥動(dòng)學(xué)有影響，值得關(guān)注。
　　隨著社會(huì)發(fā)展，飲酒成為人類的一種生活習(xí)慣，

3、白酒、啤酒、紅酒、香檳等不僅影響了人們的生活，更影響了健康。飲酒時(shí)乙醇首先經(jīng)胃吸收入血，其在胃平滑肌中的濃度高于血中的濃度，故對(duì)胃腸道的影響更為常見。有研究指出乙醇可直接損害胃粘膜、對(duì)消化道平滑肌具有毒性作用等不良反應(yīng)。
　　本課題組建立了大鼠離體胃底、胃體、胃竇、賁門和幽門環(huán)行肌的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并探索了毒蕈堿（M）受體及5-羥色胺（5-HT）受體介導(dǎo)胃平滑肌收縮的藥理學(xué)特征。但是，乙醇對(duì)大鼠離體胃底、胃體、賁門和幽門環(huán)行肌的作

4、用尚不清楚。
　　第一部分中藥銀杏葉片對(duì)苯磺酸氨氯地平在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響
　　目的：建立檢測苯磺酸氨氯地平代謝產(chǎn)物的HPLC-Orbitrap-Fusion方法，建立測定苯磺酸氨氯地平及其代謝產(chǎn)物的UPLC-MS/MS同時(shí)測定方法，通過比較單獨(dú)灌胃給予苯磺酸氨氯地平與合用中藥復(fù)方制劑銀杏葉片后大鼠體內(nèi)苯磺酸氨氯地平藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化，以及苯磺酸氨氯地平代謝產(chǎn)物的變化，探討銀杏葉片對(duì)苯磺酸氨氯地平藥動(dòng)學(xué)是否有影響。
　

5、　方法：
　　色譜條件：色譜柱：Xbridge C18色譜柱（100 mm×3 mm，3.5μm）；流動(dòng)相A：0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫；進(jìn)樣量為2μL；流速：0.6 mL/min；柱溫箱：30 ℃；樣品室溫度：4 ℃；梯度洗脫條件如下：0 min，30%B；3.5 min，50%B；8.5 min，80%B；10 min，90%B；10.5 min，90%B；11 min，30%B；內(nèi)標(biāo)：哌唑嗪；
　　質(zhì)

6、譜條件：UPLC-MS/MS：離子化方式：電噴霧離子化源（ESI）；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細(xì)管電壓3 kV；去溶劑氣流速為1000 L/h，源溫度：150 ℃，去溶劑溫度500 ℃；并選擇合適的被測物及內(nèi)標(biāo)物的檢測離子對(duì)、駐留時(shí)間、掃描時(shí)間、錐孔電壓和碰撞電壓等參數(shù)。
　　HPLC-Orbitrap-Fusion：正、負(fù)離子模式全掃描分析條件，正離子噴霧電壓：3.5 kV，負(fù)離子噴霧電壓：2.5

7、kV；鞘氣流速：40 Arb，輔助氣流速：12 Arb，尾氣流速1 Arb；離子傳輸管溫度：330 ℃，噴霧器溫度：315 ℃，掃描范圍：100-600 m/z，質(zhì)量分辨率：60000。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.采用HPLC-Orbitrap-Fusion和Mass Frontier7.0軟件分析代謝物的種類及結(jié)構(gòu)。
　　2.采用UPLC-MS/MS分析銀杏葉片對(duì)大鼠血漿中苯磺酸氨氯地平藥代動(dòng)力學(xué)的影響。將20只大鼠隨

8、機(jī)分為2組，每組10只，對(duì)照組灌胃給予2 mL蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予銀杏葉片溶液2 mL，每日一次，連續(xù)給藥15天，第16天，每只大鼠灌胃給予苯磺酸氨氯地平2 mL（相當(dāng)于氨氯地平1 mg/Kg），給藥前12 h禁食，自由飲水，分別于給藥前0.5 h和0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼底靜脈叢取血0.5 mL于肝素抗凝管內(nèi)，離心分離血漿，-20 ℃保存，備用。
　　藥動(dòng)學(xué)參數(shù)處理：測定每只大鼠各取血點(diǎn)的氨氯地

9、平血藥濃度及代謝物的峰面積，采用藥動(dòng)學(xué)軟件WinNonlin對(duì)其進(jìn)行處理得到相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism5.0、Graphpad Instart3.0依次將實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠間主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行雙因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P值小于0.05則認(rèn)為兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：苯磺酸氨氯地平、哌唑嗪的保留時(shí)間分別為3.38 min和1.12 min。血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾

10、苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)出峰及測定。苯磺酸氨氯地平的回歸曲線為Y=0.7887C+0.3851（R2=0.9996），線性范圍為0.15-60 ng/mL，定量下限為0.15 ng/mL。低（0.3 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（30 ng/mL）濃度質(zhì)控樣品溶液的日內(nèi)和日間精密度RSD均低于15%，平均回收率分別為67.67%、70.00%和80.16%，平均基質(zhì)效應(yīng)RSD分別為109%、100%、100%，放置在室溫4 h

11、、24 h與-20° C冷凍儲(chǔ)存30天，血漿樣品均穩(wěn)定。
　　未合用中藥組大鼠苯磺酸氨氯地平的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為AUC0-t：64.40±25.54 ng/mL·h；AUC0-∞：74.58±29.81 ng/mL·h；t1/2：6.91±1.64 h；Tmax：1.37±0.44 h；Cl：0.02±0.006 L/h/kg；MRT：10.17±0.60；Cmax：5.73±3.16 ng/mL。合用銀杏葉片后，苯磺酸氨氯地平

12、的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為AUC0-t：33.49±10.70 ng/mL·h；AUC0-∞：36.72±11.06 ng/mL·h；t1/2：6.70±1.07 h；Tmax：2.50±1.30 h；Cl：0.03±0.008 L/h/kg；MRT：10.26±1.43；Cmax：3.29±1.34 ng/mL。將未合用中藥組與合用銀杏葉組大鼠苯磺酸氨氯地平的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與未合用中藥組相比，AUC0-t、AUC0

13、-∞和 Cmax明顯減少，Tmax和 Cl明顯的增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　通過HPLC-Orbitrap-Fusion分析以及Mass Frontier7.0軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)的解析，共確定27種代謝物。在銀杏葉對(duì)苯磺酸氨氯地平藥動(dòng)學(xué)影響實(shí)驗(yàn)中，未合用中藥組大鼠血漿樣本中共檢測出9種代謝產(chǎn)物，分別為M2、M3、M5、M7、M14、M15、M16、M18、M23。在合用銀杏葉片組大鼠血漿樣本中共檢測出11種代謝產(chǎn)物，分別為M2、M3、

14、M5、M7、M9、M14、M16、M17、M18、M24、M22。其中代謝物 M15和 M23只存在于未合用中藥組；同樣，代謝物M9、M17、M22、M24只存在于合用銀杏葉片組。
　　結(jié)論：本文所建立的UPLC-MS/MS測定苯磺酸氨氯地平及其代謝物的方法準(zhǔn)確，靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于大鼠體內(nèi)血漿中苯磺酸氨氯地平濃度的測定；本文所建立的HPLC-Orbitrap-Fusion方法分辨率高、分析速度快，共檢測出27種代謝產(chǎn)物。適

15、用于大鼠體內(nèi)血漿中苯磺酸氨氯地平代謝物種類的檢測。并且證明，苯磺酸氨氯地平合用銀杏葉片時(shí)，后者顯著抑制大鼠體內(nèi)苯磺酸氨氯地平的吸收，加快其清除，且代謝物種類發(fā)生了改變。
　　第二部分乙醇對(duì)大鼠胃不同區(qū)域環(huán)行肌M受體和5-HT受體介導(dǎo)收縮反應(yīng)的選擇性抑制作用
　　目的：利用大鼠胃不同區(qū)域環(huán)行肌標(biāo)本，研究乙醇對(duì)M受體和5-HT受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)是否具有選擇性抑制作用。
　　方法：制備大鼠離體胃底、胃體、賁門和幽門環(huán)行肌標(biāo)本

16、，觀察卡巴膽堿（CCh）或5-羥色胺（5-HT）誘發(fā)的收縮反應(yīng)及乙醇的作用。
　　結(jié)果：0.05‰~0.5‰乙醇不影響CCh誘發(fā)的胃底和賁門環(huán)行肌收縮反應(yīng)以及5-HT誘發(fā)的胃底和胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)。但是0.1‰和0.5‰乙醇顯著抑制了CCh誘發(fā)的胃體環(huán)行肌收縮，Emax值（g）由對(duì)照組的12.18±0.33降至10.88±0.41，-LogEC50值由對(duì)照組的6.33±0.05降至6.12±0.06。同濃度乙醇顯著抑制了CCh誘發(fā)

17、的幽門環(huán)行肌收縮， Emax值（g）由對(duì)照組的2.87±0.15降至2.2±0.13，-LogEC50值由對(duì)照組的6.49±0.10降至6.05±0.09。乙醇預(yù)處理賁門環(huán)行肌前，5-HT誘發(fā)賁門環(huán)行肌收縮的Emax值（g）是2.93±0.35，-LogEC50值是6.17±0.21；0.1‰和0.5‰濃度的乙醇顯著抑制了5-HT誘發(fā)的賁門環(huán)行肌收，其Emax值（g）降至2.1±0.30，-LogEC50值未發(fā)生顯著改變。
　　結(jié)