構(gòu)建響應(yīng)外界信號的生物分子開關(guān).pdf

1、在過去的數(shù)年時間中，合成生物學(xué)已在生命科學(xué)領(lǐng)域的各個學(xué)科中受到越來越多的關(guān)注。合成生物學(xué)是一門交叉學(xué)科，是通過將工程科學(xué)領(lǐng)域中的各種元件設(shè)備有效合理組合，從而實現(xiàn)自定義設(shè)計基因網(wǎng)絡(luò)控制體系的目的。以人工設(shè)計的方式將天然系統(tǒng)中具有最佳特性的元件有效組合，可使調(diào)控體系具有可擴(kuò)展性、可理解性和便于使用的特性，并有助于實現(xiàn)既定目標(biāo)，如此基于合成生物學(xué)設(shè)計的策略是優(yōu)于傳統(tǒng)工程策略的。到目前為止，多種人工設(shè)計的合成生物學(xué)控制系統(tǒng)已被成功用于生物系統(tǒng)

2、中，并實現(xiàn)了對內(nèi)部化境和外部環(huán)境中刺激信號的有效鑒定。本論文中，我們描述了幾種合成生物學(xué)策略用于構(gòu)建模塊化調(diào)控元件，該類元件可感知外界刺激信號，促使體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答響應(yīng)，以此實現(xiàn)了對基因表達(dá)的特異性控制，并且實驗證明某些調(diào)控元件具有高效可控的調(diào)節(jié)特性。
　　首先，我們運用合成生物學(xué)策略構(gòu)建人工設(shè)計的RNA開關(guān)使其能響應(yīng)小分子化合物。在實驗設(shè)計階段，我們尋求一種行之有效的設(shè)計方法將適配體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域在單一緊湊結(jié)構(gòu)中組合起

3、來，如此使構(gòu)建的RNA開關(guān)既具有對小分子化合物的高親和力，又具有核糖開關(guān)的特性實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)前運用SELEX和體外篩選技術(shù)，雖獲取了多種對配體具有高親和力的DNA和RNA適配體，但這種體外定向進(jìn)化篩選策略無法獲取具有構(gòu)象變化特性的RNA開關(guān)，這導(dǎo)致從頭設(shè)計響應(yīng)小分子化合物的核糖開關(guān)仍是一項有挑戰(zhàn)性的工作。在本實驗研究中，我們設(shè)計了一種獨特的體外篩選策略可直接篩選具有構(gòu)象變化特性的RNA分子開關(guān)。實驗中所用的RNA篩選庫是在已知

4、的茶堿適配體基礎(chǔ)上設(shè)計而成的，通過體外篩選可從RNA庫中獲取特定的RNA序列，該序列在茶堿存在的情況下具有顯著的構(gòu)象變化和DNA-RNA相互作用特性，并具有類似于天然核糖開關(guān)所特有的調(diào)節(jié)功能，可用于生物體內(nèi)實現(xiàn)對目的基因的精確調(diào)控。此外本實驗基于SELEX技術(shù)設(shè)計的方法學(xué)可有助于設(shè)計更加復(fù)雜的實驗體系和篩選對環(huán)境因素和有毒化學(xué)物響應(yīng)的RNA開關(guān)，并可根據(jù)不同配體的特異性和研究目的對RNA調(diào)控元件進(jìn)行相應(yīng)的改造，以此創(chuàng)建出受特定小分子化合

5、物調(diào)控的RNA級聯(lián)線路。
　　同時，光遺傳學(xué)作為一種高效的調(diào)控策略可實現(xiàn)在時間和空間維度上的精確調(diào)控，并有助于我們?nèi)フJ(rèn)識和了解復(fù)雜的生物系統(tǒng)。實驗研究中，我們基于噬菌體T7RNA聚合酶構(gòu)建了一系列可受光激活的基因開關(guān)。利用一種獨特的設(shè)計策略，將T7RNA聚合酶在指定位置拆分，獲取的拆分體系與調(diào)控結(jié)構(gòu)域融合，使T7RNA聚合酶的自組裝過程受調(diào)控結(jié)構(gòu)域的控制，以此實現(xiàn)T7RNA聚合酶活性的可誘導(dǎo)調(diào)控。實驗中將光照可激活的VVD結(jié)構(gòu)域和

6、其對應(yīng)的突變體作為調(diào)控結(jié)構(gòu)域與T7RNA聚合酶以不同方式組合，以此構(gòu)建的基因開關(guān)具有可控特性，可在避光條件下可完全失去活性，且在光照條件下聚合酶活性顯著升高。此外在特定位置拆分T7RNA聚合酶并以此構(gòu)建的基因開關(guān)其具有兩種調(diào)控模式，既可以通過光誘導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，也可以通過光介導(dǎo)的別構(gòu)效應(yīng)促使T7RNA聚合酶恢復(fù)活性。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)在特定位置拆分T7RNA聚合酶所獲取的拆分體系具有高度模塊化的特性，可與不同類型

7、的調(diào)控結(jié)構(gòu)域如化學(xué)可誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域融合，實現(xiàn)基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)調(diào)控。綜上，基于T7RNA聚合酶構(gòu)建的基因開關(guān)作為可靠便利的調(diào)控工具可在不同環(huán)境條件下光激活基因表達(dá);甚者，對T7RNA聚合酶拆分位置和調(diào)控結(jié)構(gòu)域不同調(diào)控方式的研究可有助于對T7RNA聚合酶和其他相關(guān)蛋白進(jìn)行更深層次的研究。
　　此外，合成生物學(xué)的中心目標(biāo)之一是通過可預(yù)測的方式調(diào)控基因表達(dá)以此實現(xiàn)對多種細(xì)胞功能的控制。在此之前，實驗研究中所使用的調(diào)控元件基本上都是基于蛋白

8、質(zhì)構(gòu)建的;但是隨著對RNA結(jié)構(gòu)特征和功能特性有了越來越全面的認(rèn)識和了解后，基于RNA構(gòu)建的調(diào)控元件用于基因表達(dá)調(diào)控將成為可能。相較于基于蛋白質(zhì)構(gòu)建的調(diào)控元件，RNA具有某些顯著的優(yōu)點，其便于設(shè)計，可正交調(diào)控細(xì)胞功能并有助于緩解宿主細(xì)胞自身的負(fù)擔(dān)。本實驗中，我們將CRISPR-dCas9系統(tǒng)和反義RNA(asRNA)系統(tǒng)組合使用，以可編輯的方式實現(xiàn)對E.coli細(xì)胞中特定基因的抑制或解抑制。實驗證明asRNA-sgRNA之間特異性的相互作