基于分子開關(guān)的微流控芯片構(gòu)建及其在生物分析中的應(yīng)用.pdf

1、人們一直致力于采用宏觀手段對(duì)微觀世界進(jìn)行操控，從而通過(guò)改變物質(zhì)微結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)其宏觀性質(zhì)的改變。其中通過(guò)對(duì)物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)、構(gòu)成、構(gòu)象、形態(tài)、氧化態(tài)等性質(zhì)的控制來(lái)可逆的改變物質(zhì)性質(zhì)在近年來(lái)引起了越來(lái)越多的興趣?？赡孀儞Q類似于“開/關(guān)”切換，這類操控使得我們能夠隨心所欲的對(duì)物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行控制，達(dá)到智能操控、反復(fù)利用的目的。因此，對(duì)具有“開/關(guān)”性質(zhì)的物質(zhì)、體系的研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。而要構(gòu)建這類物質(zhì)和體系，需要從原子或分子層面上開始建造特殊

2、的微觀結(jié)構(gòu)。自下而上的以原子，分子為基本單元，根據(jù)人們的意愿進(jìn)行設(shè)計(jì)和組裝，從而構(gòu)筑成具有特定開關(guān)功能的器件，這些器件就被形象的稱為“分子開關(guān)”。
　　 所謂分子開關(guān)泛指結(jié)構(gòu)上組織化了的具有“開/關(guān)”功能的化學(xué)體系。它們具有雙穩(wěn)態(tài)的量子化體系，外部條件的變化能激勵(lì)分子開關(guān)在這兩種穩(wěn)態(tài)間切換。常用于激勵(lì)分子開關(guān)的因素包括光、電、熱、磁、化學(xué)能(酸堿度、特殊分子和離子)等，這些條件的變化在微觀上能引起電子和原子核的重排，使得分子的形

3、狀、化學(xué)鍵的生成或斷裂、以及旋轉(zhuǎn)等性質(zhì)會(huì)隨之變化，這些幾何和化學(xué)的變化在宏觀上表現(xiàn)出親疏水性、顏色、水溶性等性質(zhì)的變化，能實(shí)現(xiàn)信息傳輸?shù)墓δ?。隨著微電子技術(shù)和生物工程這兩項(xiàng)高科技的互相滲透，分子開關(guān)實(shí)際上己為研制分子器件提供了可能。
　　 智能化表面(Smart surface)是一類組織化、集成化、平面化的分子開關(guān)，是具有可操控的開關(guān)功能的表面。常見的智能表面由聚合物、自組裝單分子層(Self-assembled monola

4、yer，SAM)、特殊的納米金屬氧化物等組成，激勵(lì)它發(fā)生性質(zhì)可逆轉(zhuǎn)化的因素包括溫度、光照、電場(chǎng)、pH值、溶劑等等。在這些外界激勵(lì)下，表面分子可以發(fā)生可逆的構(gòu)象轉(zhuǎn)化、構(gòu)型轉(zhuǎn)化、氧化態(tài)的轉(zhuǎn)化等等，從而在宏觀上，使整個(gè)表面呈現(xiàn)出親疏水性、光學(xué)性質(zhì)、帶電性等性質(zhì)的可逆轉(zhuǎn)化，即可呈現(xiàn)出“開/關(guān)”的性質(zhì)。
　　 微流控器件是微型全化學(xué)分析系統(tǒng)(Micro total analysis system，μ-TAS)的核心部分，是可用于生物分離分

5、析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)療診斷等的有效手段。由于其操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速、試劑消耗量少，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和在線監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景，一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。微流控芯片是一類被廣泛研究和使用的微流控器件，目前對(duì)微流控芯片的研究十分廣泛和深入，根據(jù)不同的用途，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種多樣的芯片，并將其成功的用在很多研究領(lǐng)域，包括傳感器，化學(xué)反應(yīng)器，生物反應(yīng)器等。
　　 本論文基于超分子包合物、自組裝技術(shù)、溫敏生物復(fù)合物等要素構(gòu)建兩類具有開關(guān)功能的智能表

6、面，成功將這些智能化的表面用于蛋白質(zhì)程序吸附釋放以及抗原抗體的可逆識(shí)別。并基于這些智能表面制作了智能微器件--微流控芯片。一類是對(duì)電壓敏感的智能表面。這是一種低密度的自組裝單分子層(Low densitySAM，LD-SAM)，它是電壓可操控的親疏水開關(guān)，其親疏水性可隨外加電壓變化而切換，并且能實(shí)現(xiàn)對(duì)抗生物素(Avidin)、鏈霉抗生物素(Streptavidin)的可控吸附。另一類是和溫敏智能表面，利用溫敏高分子材料聚-N異丙基丙烯酰

7、胺(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAAm)與抗BSA抗體合成的生物復(fù)合物，構(gòu)建了具有溫度敏感開關(guān)功能的可再生免疫表面。該方法實(shí)現(xiàn)了免疫表面的再生，使其能夠重復(fù)使用，同時(shí)為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相互作用過(guò)程提供了一個(gè)新平臺(tái)。
　　 進(jìn)一步的，我們將這些智能表面引入微流控芯片，構(gòu)建了有開關(guān)功能的電壓敏感微流控芯片，并成功將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)的可控吸附釋放及分離中。該芯片制作成本低、能耗少、試劑消耗少，使

8、用方便，易于檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用前景。也是一個(gè)新型的基于自組織單分子層構(gòu)建智能微器件的成功范例。還嘗試了將上述溫敏免疫表面修飾到微流控芯片的槽道中，以期構(gòu)建溫度敏感的免疫型微流控芯片，實(shí)現(xiàn)在微通道中的可控免疫識(shí)別。
　　 本論文共六章內(nèi)容，主要摘要如下：
　　 第一章綜述了分子開關(guān)、智能表面和微流控芯片的研究現(xiàn)狀及其相關(guān)技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。分子自組裝和高分子聚合物是構(gòu)建分子開關(guān)的兩條重要途徑。自組裝單分子層是

9、構(gòu)膜分子與基底材料間發(fā)生物化作用而自發(fā)形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定、排列規(guī)則的單層分子膜。這種構(gòu)膜方式，可以容易的為表面引入各種各樣的功能團(tuán)，這就為制備具有多種不同功能的智能化表而打下了很好的基礎(chǔ)。溫敏材料是指對(duì)溫度有響應(yīng)并能發(fā)生性質(zhì)變化的一類材料。具有“溫度開關(guān)”特性的PNIPAAm是被廣泛研究的溫敏高分子材料。利用它對(duì)溫度響應(yīng)的敏感性，使其在可控藥物傳輸、免疫分析、細(xì)胞培養(yǎng)等研究領(lǐng)域都有著廣泛的潛力。
　　 第二章介紹了基于自組裝技

10、術(shù)構(gòu)建對(duì)電壓敏感的親疏水開關(guān)表面，及其在蛋白質(zhì)可控吸附方面的應(yīng)用。該工作基于超分子包合物的概念，利用環(huán)糊精分子控制長(zhǎng)鏈巰酸分子的間距，并通過(guò)自組裝方法在金表面構(gòu)建了包合物自組裝膜，再以乙醇作為高效的洗脫溶劑，得到間距均一、性能穩(wěn)定的低密度十六巰酸分子LD-SAM，即為對(duì)電壓敏感的具有可逆親/疏水性性質(zhì)的智能化表面。以高密度自組裝膜表而的覆蓋度為100％計(jì)算可知，α，β，γ三種環(huán)糊精分子構(gòu)建的低密度自組裝膜表面的覆蓋度分別為61.2％，4

11、5.3％和29.2％。通過(guò)改變外加電壓，引發(fā)巰酸分子的構(gòu)型變化，從而實(shí)現(xiàn)表面的親水/疏水性能的轉(zhuǎn)換。利用質(zhì)譜，核磁，交流阻抗，QCM，熒光等多種檢測(cè)手段論證的該智能表面的制成，并用接觸角實(shí)驗(yàn)證明了智能表面對(duì)電壓的可逆響應(yīng)。采用熒光標(biāo)記抗Avidin、Streptavidin蛋白分子作為研究對(duì)象，考察十六巰酸LD-SAM智能表面對(duì)帶不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)的可控吸附。結(jié)果證明十六巰酸分子LD-SAM對(duì)帶正電的Avidin蛋白有明顯的電壓控制的吸

12、附作用。
　　 第三章是進(jìn)一步的將上述智能表面“移植”到微流控芯片體系，發(fā)展了兩類利用“分子開關(guān)”原理構(gòu)建的智能微流控芯片，并將其成功用于蛋白質(zhì)的可控吸附中。本章利用成本低，加工簡(jiǎn)單的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)有機(jī)玻璃為制作微流控芯片的材料，利用熱壓法制作“一字槽”的芯片，用電子濺射法在芯片的槽道表面鍍金，作為整個(gè)芯片功能的核心區(qū)域，然后在對(duì)金面進(jìn)行一系列的功能化修飾。在這一章的工作中，我們不僅直接將基于十六巰酸分子LD-SA

13、M制作的智能表面修飾到芯片槽道中，得到智能化的巰酸微流控芯片(COOH-芯片)，還進(jìn)一步擴(kuò)展思路，設(shè)計(jì)制作了基于巰胺分子LD-SAM的智能表面，其表面分子的末端帶有胺基，不同于十六巰酸分子LD-SAM末端所帶的羧基。這種表面與巰酸表面相反，在特定條件下對(duì)帶負(fù)電的被分析物有可控的吸附作用。
　　 COOH-芯片對(duì)帶正電的蛋白質(zhì)有可控的吸附作用?；诖藥€胺分子LD-SAM制得的巰胺微流控芯片(NH2-芯片)對(duì)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)有可控的吸

14、附作用。這一工作是利用智能表面制作智能器件的成功嘗試。
　　 第四章將上述兩類智能微流控芯片進(jìn)一步應(yīng)用于蛋白質(zhì)的程序吸附/釋放，以及混合蛋白質(zhì)的可控分離。以Avidin和Streptavidin為模型蛋白實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物的分離，采用熒光檢測(cè)、激光誘導(dǎo)熒光、共聚焦熒光顯微鏡等手段進(jìn)行表征，分離效果理想。對(duì)COOH-芯片先后施加負(fù)、正電壓能夠先吸附溶液中的Avidin，在轉(zhuǎn)變電壓后將其釋放，因此該芯片能從Avidin/Strepta

15、vidin混合物中將Avidin分離出來(lái)，回收率超過(guò)80％；對(duì)NH2-芯片先后施加正、負(fù)電壓能夠?qū)⒒旌系鞍字械膸ж?fù)電的Streptavidin吸附，而在轉(zhuǎn)變電壓后再釋放出來(lái)，從而也實(shí)現(xiàn)了蛋白分離，回收率也超過(guò)了80％。另外還用COOH-芯片成功的從混合的Avidin/Streptavidin蛋白中分離出了低含量的Avidin(Avidin與Streptavidin的摩爾比為1:1000)，因此這種基于電壓敏感的智能表面的微流控芯片有望成

16、為一種新的分離低豐度蛋白的微器件，這對(duì)于蛋白組學(xué)微分析系統(tǒng)有重要的意義。
　　 第五章是基于溫敏聚合物的表面分子開關(guān)構(gòu)建及抗原抗體可逆識(shí)別界面和微流控器件的研究。將溫敏高分子材料PNIPAAm與抗BSA抗體合成的生物復(fù)合物(Bioconjugate)組裝到金表面，得到的溫敏免疫表面能對(duì)溫度做出響應(yīng)，可逆的與對(duì)應(yīng)抗原BSA進(jìn)行識(shí)別。這種溫敏高分子材料的形態(tài)隨溫度發(fā)生變化，對(duì)抗原結(jié)合過(guò)程中造成的空間位阻不同，從而影響抗原抗體的結(jié)合，

17、能使已結(jié)合的抗原抗體分離，由此實(shí)現(xiàn)抗體表面的再生。再生率最高可以達(dá)到89％以上，與文獻(xiàn)報(bào)道的有機(jī)溶液再生表面法(再生率80％-92％)相當(dāng)，而且這個(gè)方法基本沒有破壞生物識(shí)別體系的活性和環(huán)境，抗原抗體均可重復(fù)利用，這種溫敏開關(guān)免疫傳感器可重復(fù)使用30次以上，抗疲勞性較好。我們還初步嘗試將之應(yīng)用于微流控芯片體系，有望發(fā)展利用溫敏“分子開關(guān)”原理構(gòu)建的免疫型微流控芯片。
　　 第六章對(duì)整個(gè)論文工作進(jìn)行了全面總結(jié)，并對(duì)下一步的工作進(jìn)行了