間尼索地平對(duì)映體在腸道菌群中代謝以及對(duì)細(xì)胞色素P450酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用機(jī)制研究.pdf

1、間尼索地平（m-nisoldipine）[化學(xué)名稱：1,4-二氫-2,6-二甲基-4-（3-硝基苯基）-3,5-吡啶二羧酸甲酯異丁酯]是由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院首次合成的一類新型二氫吡啶類藥物，存在一個(gè)手性中心，可拆分為兩個(gè)不同的光學(xué)對(duì)映體（R,S-m-nisoldipine）。間尼索地平與尼索地平（nisoldipine）為同分異構(gòu)體，藥理活性相當(dāng)，但光穩(wěn)定性較優(yōu)，主要用于高血壓和心臟病的防治。
　　前期實(shí)驗(yàn)表明，間尼索地平原型藥物

2、排泄較少，主要以代謝物形式排出體外，并且目前主要研究其對(duì)映體在血液中代謝物情況，對(duì)于其在腸道菌群中代謝研究較少，故有必要對(duì)這方面展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，為臨床研究提供依據(jù)。
　　肝臟作為藥物代謝的重要器官，是多數(shù)代謝反應(yīng)的發(fā)生場(chǎng)所，CYP450酶是參與藥物代謝反應(yīng)的重要酶類，并容易被藥物誘導(dǎo)或抑制，了解藥物與CYP450酶的作用關(guān)系能夠?yàn)樗幬镒饔脵C(jī)制研究提供理論依據(jù)。以往研究已證明外源性藥物對(duì)CYP450酶的誘導(dǎo)主要是經(jīng)核受體PXR介導(dǎo)的，間尼

3、索地平在此方面的相關(guān)研究尚屬空白，因此有必要對(duì)其此方面進(jìn)行研究。
　　本試驗(yàn)應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，采用大鼠腸道菌群液溫孵體系，對(duì)間尼索地平代謝途徑及其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步理解其作用機(jī)制提供依據(jù)和技術(shù)支持。采用RT-qPCR技術(shù)，以大鼠作為研究對(duì)象，系統(tǒng)分析了在不同劑量下，長(zhǎng)期給予間尼索地平對(duì)CYP450酶五種亞型的影響。利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，建立hPXR介導(dǎo)的CYP450酶的藥物誘導(dǎo)劑體外篩選體系，考

4、察間尼索地平對(duì)映體對(duì)CYP450酶的誘導(dǎo)作用機(jī)制。本研究旨在預(yù)測(cè)間尼索地平與其它藥物相互作用，并指導(dǎo)臨床合理用藥。
　　第一部分基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的大鼠腸道菌轉(zhuǎn)化間尼索地平對(duì)映體的體外代謝研究
　　目的：建立腸道菌轉(zhuǎn)化研究間尼索地平對(duì)映異構(gòu)體代謝產(chǎn)物的方法，確定代謝物的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化途徑。
　　方法：將R,S-間尼索地平分別與大鼠腸道菌于體外厭氧溫孵培養(yǎng)2 h，用正己烷-乙醚（1:1）萃取，離心后取上清液氮

5、氣吹干，復(fù)溶后進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析。色譜條件：采用Poroshell120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm,2.7μm）色譜柱，以0.05％甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速400μL·min-1，柱溫40℃；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI源），負(fù)離子模式檢測(cè)。比較樣品和相應(yīng)的菌空白、藥物空白的數(shù)據(jù)，檢測(cè)推斷其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：在對(duì)映體溫孵液中檢測(cè)到原藥及其3種代謝產(chǎn)物：1,4-二氫-2,6

6、-二甲基-4-（3-氨基苯基）-3,5-吡啶二羧酸異丁基甲酯、1,4-二氫-6-甲基-4-（3-硝基苯基）-3,5-吡啶二羧酸異丁基甲酯和1,4-二氫-2,6-二甲基-4-（3-硝基苯基）-3,5-吡啶二羧酸二甲酯，并推斷MNS的腸道菌轉(zhuǎn)化途徑。
　　結(jié)論：間尼索地平在腸道菌從中發(fā)生生物轉(zhuǎn)化而形成代謝產(chǎn)物，對(duì)映體的代謝產(chǎn)物種類相同，代謝途徑主要為還原和氧化反應(yīng)。
　　第二部分：基于RT-qPCR技術(shù)的間尼索地平對(duì)CYP450

7、酶活性的影響
　　目的：研究間尼索地平對(duì)大鼠CYP450酶CYP1A2，CYP2B，CYP2C11， CYP2D，CYP3A1亞型的影響。
　　方法：將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，間尼索地平低、中、高劑量組（2.5，5.0，12.5 mg·kg-1）。各組大鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)灌胃15天后處死，并用RT-qPCR技術(shù)定量分析大鼠肝組織中CYP1A2，CYP2B，CYP2C11， CYP2D，CYP3A1的mRNA表達(dá)水平。<

8、br>　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，間尼索地平能下調(diào)CYP1A2，CYP2B，CYP2D mRNA的表達(dá)，可以上調(diào)CYP2C11，CYP3A1 mRNA的表達(dá)，并且呈顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，低和高劑量組mRNA的表達(dá)水平有顯著性差異。
　　結(jié)論：間尼索地平對(duì)CYP450酶各亞型mRNA水平有調(diào)節(jié)作用，提示間尼索地平可能通過(guò)影響CYP450酶對(duì)其它藥物的代謝發(fā)揮作用。
　　第三部分：間尼索地平對(duì)映體對(duì)hPXR介導(dǎo)的CYP450酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

9、作用機(jī)制研究
　　目的：建立hPXR介導(dǎo)的CYP450酶的藥物誘導(dǎo)劑體外篩選體系，考察R,S-間尼索地平對(duì)CYP450酶的誘導(dǎo)是否由hPXR介導(dǎo)。
　　方法：利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，將包含hPXR蛋白識(shí)別和結(jié)合調(diào)控元件的CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4啟動(dòng)子序列插入報(bào)告基因上游，將表達(dá)載體和報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，分別用9.7、2.425和1.2125μg·mL-1的R,S-間尼索地平處理48 h后裂解細(xì)胞

10、進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。
　　結(jié)果：R,S-間尼索地平實(shí)驗(yàn)組與0.1%DMSO溶媒對(duì)照組存在差異（P＜0.05）。R-間尼索地平可以通過(guò)hPXR誘導(dǎo)CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4的表達(dá)。S-間尼索地平可以通過(guò)hPXR誘導(dǎo)CYP2B6和CYP2C9的表達(dá)，但是對(duì)CYP3A4沒(méi)有影響。
　　結(jié)論：該研究成功構(gòu)建hPXR介導(dǎo)的CYP450酶藥物誘導(dǎo)劑的體外篩選體系，R,S-間尼索地平通過(guò)激活hPXR介導(dǎo)了CYP450酶的