P4Hα1在不同剪切力誘導動脈粥樣硬化中的作用及對平滑肌細胞膠原影響.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　?、?過表達P4Hα1對不同剪切力誘導的ApoE-/-小鼠粥樣硬化斑塊的影響
　　目的：
　　1.通過慢病毒載體介導P4Hα1基因的過表達，觀察過表達P4Hα1對剪切力作用下的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　2.比較不同剪切力作用下，P4Hα1介導對動脈粥樣硬化形成的影響。
　　方法：
　　1.構建動物模型與分組
　　60只8周齡雄性Apo

2、E-/-小鼠在手術前2周始全程給予高脂飲食（0.25％膽固醇+15％脂肪）。參照Cheng等人文獻報道，對右頸總動脈實施套管術。
　　60只小鼠于右側頸總動脈放置硅膠套管，術后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周，將小鼠隨機分為三組(n=20):NS組（Mock組）、空病毒組（Lenti-EGFP組）及Lenti-P4Hα1組。每組小鼠分別于尾靜脈注射200ul生理鹽水、3.5×106TU的Lenti-EGFP病毒懸液及3.5×106TU的P4Hα1

3、病毒懸液。轉染后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周，行安樂死后取材。
　　2.血液學指標的檢測
　　處死小鼠前麻醉小鼠后從尾靜脈留取血液，在4℃以2500r/min離心15分鐘，留取血清，血清中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)及甘油三酯(TG)均采用酶學法進行檢測;ELISA試劑盒檢測血清中的羥脯氨酸。
　　3.斑塊組織免疫組化及病理學檢查
　　右頸動脈組織取材后置于4％甲醛固定液中固定，

4、采用OCT包埋標本，以5μ m的厚度連續(xù)冰凍切片，分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色分析斑塊的形態(tài);油紅O染色用于分析脂質沉積情況;天狼猩紅-苦味酸染色用于分析膠原的含量;CD68免疫組化染色觀察巨噬細胞的含量。
　　結果：
　　1.實驗動物一般情況
　　三組實驗小鼠血的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平和體重沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05);羥脯氨酸水平在lenti-P4Hα1組比其他兩組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜

5、0.05)。表明過表達P4Hα1對小鼠體內(nèi)的血脂水平無明顯影響。
　　2.慢病毒轉染后P4Hα1過表達效率檢測
　　Western Blot及RT-PCR檢測三組小鼠頸動脈斑塊組織內(nèi)P4Hα1蛋白及mRNA表達水平。結果顯示，與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)P4Hα1的蛋白表達水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)P

6、4Hα1的mRNA水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.三組小鼠不同剪切力部位斑塊面積的比較
　　三組小鼠斑塊組織行HE染色，測量三組不同剪切力部位斑塊的面積，在Mock組及Lenti-EGFP組，OSS部位斑塊面積較LSS部位減小(P＜0.05);在LSS部位，Lenti-P4Hα1組較MOCK組及Lenti-EGFP組斑塊面積增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);在OSS部位，斑塊面積在Lenti-P4

7、Hα1組較MOCK組及Lenti-EGFP組均增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　4.不同剪切力部位三組小鼠頸動脈斑塊成分比較
　　天狼猩紅染色檢測斑塊內(nèi)膠原含量，結果顯示:在Mock組及Lenti-EGFP組，OSS部位斑塊內(nèi)膠原含量較LSS部位增多(P＜0.01);在LSS部位，與Mock組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)膠原的含量及纖維帽的厚度增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，

8、P＜0.05);在OSS部位:Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)膠原的含量及纖維帽的厚度增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　油紅O染色法測定斑塊中的脂質含量，結果顯示:在LSS部位，P4Hα1轉染組斑塊內(nèi)脂質含量與生理鹽水組及空病毒組比較無顯著性差異(P＞0.05);在OSS部位，脂質聚集在三組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　CD68染色檢測斑塊中巨噬細胞的浸潤，結果發(fā)現(xiàn):在LSS部位，與Mock組及Lenti

9、-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)巨噬細胞含量明顯減少(P＜0.01);在OSS部位，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)巨噬細胞含量明顯減少(P＜0.01)。
　　5.P4Hα1過表達對斑塊中TGF-β1水平的影響
　　Western Blot檢測各組小鼠頸動脈斑塊組織內(nèi)TGF-β1蛋白表達水平，結果發(fā)現(xiàn):與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)TGF-β1的蛋白表達水平明顯增高(P＜0

10、.01)。
　　結論：
　　1.過表達P4Hα1使LSS和OSS所誘導的動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞含量減少，膠原成分及纖維帽厚度增加，脂質含量無明顯變化，增加斑塊的穩(wěn)定性;
　　2.過表達P4Hα1增加LSS和OSS所誘導的動脈粥樣硬化斑塊的大小，TGF-β1表達增加。
　　Ⅱ 震蕩剪切力調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞P4Hα1表達及對膠原代謝的作用
　　目的：
　　1.觀察震蕩剪切力刺激下血管平滑肌細胞P4Hα

11、1表達的變化;
　　2.研究震蕩剪切力刺激下P4Hα1調(diào)節(jié)平滑肌細胞膠原代謝的作用;
　　3.探討JNK-FOXO1通路在震蕩剪切力對平滑肌細胞P4Hα1表達調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法：
　　1.人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)的培養(yǎng)
　　將新購買的HASMCs細胞在無菌培養(yǎng)瓶中生長至融合時，吸出瓶中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍，加入適量提前預熱的0.25％胰酶，于顯微鏡下觀察細胞呈圓粒狀時加入適量的完全培養(yǎng)

12、基，吹打細胞，將混合液移至離心管中，800rpm/分離心5分鐘，棄掉上清，將細胞懸液加入新的培養(yǎng)瓶中，充分混勻，置于5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　2.人主動脈平滑肌細胞剪切力干預
　　選取4-7代的HASMCs接種于包被有Ⅰ型鼠尾膠原高壓消毒過的載玻片上。細胞生長至密度約90％時，在37℃，5％CO2的條件下給予人主動脈平滑肌細胞靜止培養(yǎng)或0±4dyne/cm2病理性震蕩剪切力刺激0、3、6、12、24小時，觀察

13、震蕩剪切力對平滑肌細胞中P4Hα1、膠原、FOXO1、JNK表達的影響，以進行后續(xù)的進一步研究。
　　3.P4Hα1基因過表達慢病毒載體的轉染
　　P4Hα1基因過表達慢病毒載體及空載體均購自上海吉凱生物基因技術有限公司，轉染步驟按照慢病毒轉染手冊進行，轉染后24小時換液，48小時后觀察熒光表達情況，評估慢病毒轉染效率。
　　結果：
　　1.震蕩剪切力條件下人主動脈平滑肌細胞P4Hα1的表達下調(diào)
　　與對照

14、組比較，震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細胞中P4Hα1 mRNA及蛋白的表達，震蕩剪切力刺激下P4Hα1的表達在6小時、12小時及24小時下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中12小時下調(diào)最明顯。
　　2.震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細胞collagenⅠ、collagenⅢ的表達
　　與靜止對照組相比，震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細胞中collagenⅠ、collagenⅢ的表達，震蕩剪切力干預下collagenⅠ、collagenⅢ的表達在

15、6小時、12小時下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.P4Hα1參與震蕩剪切力對平滑肌細胞膠原代謝的調(diào)節(jié)
　　震蕩剪切力干預下過表達P4Hα1增加膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示震蕩剪切力干預下P4Hα1參與對平滑肌細胞膠原代謝的調(diào)節(jié)。
　　4.震蕩剪切力干預下JNK信號通路參與平滑肌細胞P4Hα1的表達下調(diào)
　　Western Blotting結果顯示:與對照組比較，震蕩

16、剪切力干預下P-JNK/JNK的水平在3小時、6小時、12小時表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　與靜止對照組比較，震蕩剪切力干預下HASMCs中FOXO1蛋白的表達下調(diào)，F(xiàn)OXO1蛋白的表達在3小時、6小時、12小時下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　JNK通路抑制劑SP600125預處理平滑肌細胞1小時，給予平滑肌細胞震蕩剪切力干預12小時，Western Blotting結果顯示:震蕩剪切力干預