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文檔簡介
1、論文Ⅰ:
過表達(dá)P4Hα1對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響
1.背景
目前,心腦血管病仍然是全球引起致死致殘的主要原因,而且心腦血管病的發(fā)病率仍然呈上升趨勢。動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性與斑塊內(nèi)膠原含量減少密切相關(guān)。增加斑塊中膠原含量,對穩(wěn)定斑塊,減少斑塊破裂,降低臨床血管事件的發(fā)生具有重要的意義。
Ⅰ型、Ⅲ型膠原是動脈及粥樣硬化斑塊中主要的膠原類型,在斑塊重塑過程中發(fā)揮著
2、重要作用。成熟的Ⅰ型和Ⅲ型膠原,尤其是纖維帽中的膠原大分子可形成保護(hù)層,對抗斑塊外的拉力及剪切力的應(yīng)變,是防止斑塊破裂的有效阻抗。除此之外,Ⅰ型和Ⅲ型膠原能抑制動脈平滑肌細(xì)胞的增生和遷移,減少基質(zhì)金屬蛋白酶與炎性因子釋放,與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。
P4Hα1膠原合成的關(guān)鍵酶。能通過膠原的翻譯后修飾作用促進(jìn)膠原的成熟與分泌。理論上,在前膠原表達(dá)豐富的前提下,過表達(dá)膠原合成的關(guān)鍵酶P4Hα1能夠促進(jìn)脯氨酸的羥化,從而增加成熟膠
3、原的表達(dá)。
動脈粥樣硬化斑塊是脂質(zhì)和膠原等成份在大中型動脈內(nèi)中膜的異常聚集。它是一個漸進(jìn)的病理過程。不同時期的動脈粥樣硬化斑塊有不同的組織學(xué)特征。斑塊內(nèi)的各種成分所占的比例也隨斑塊的不同階段而有所增減。同樣,動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中P4Hα1的表達(dá)也會有所不同,明確P4Hα1在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中的表達(dá)規(guī)律,對理解動脈粥樣硬化斑塊病理過程及正確選擇治療干預(yù)的時間窗具有一定的意義。
研究表明,動脈粥樣硬
4、化斑塊中膠原成分的減少與急性血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。目前公認(rèn)的易損斑塊的組織學(xué)特征是纖維帽薄,膠原含量少,脂質(zhì)含量多(>40%),炎性因子浸潤,伴有血管的正性重構(gòu)。文獻(xiàn)表明,P4Hα1能有效的促進(jìn)膠原的合成,動脈粥樣硬化斑塊中的Ⅰ型、Ⅲ型膠原能有效的穩(wěn)定斑塊,降低斑塊的的易損指數(shù)。我們以往的許多研究措施可以間接地通過提高斑塊中P4Hα1的表達(dá)而增加斑塊內(nèi)膠原的含量,提高斑塊的穩(wěn)定性。但是直接在動脈粥樣硬化斑塊中過表達(dá)P4Hα1觀察斑塊穩(wěn)
5、定性的研究,到目前為止尚無相關(guān)的報道。
此外,PTEN是近年來被發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因,具有抑癌作用,同時,還參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡,與細(xì)胞體積大小及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有密切關(guān)系。在血管病中,被稱為平滑肌細(xì)胞增生的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,能抑制早期斑塊新生內(nèi)膜的增生,并且膠原與PTEN的關(guān)系密切。但是,斑塊中過表達(dá)P4Hα1,對PTEN有何影響,到目前為止,未見相關(guān)報道。
基于此,提出本研究的科學(xué)假說。在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的早
6、、晚不同期,即套管4周的斑塊和套管12周的斑塊中過表達(dá)P4Hα1,能增加動脈粥樣硬化斑塊中P4Hα1蛋白的表達(dá),增加動脈粥樣硬化斑塊中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量,降低斑塊的易損指數(shù),發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。不同階段斑塊的組織學(xué)特征及形態(tài)學(xué)特征可能與過表達(dá)P4Hα1影響PTEN的表達(dá)有關(guān)。
研究目的:
(1)探討ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中P4Hα1的表達(dá)變化規(guī)律。
(2)在ApoE-/-小鼠
7、早、晚不同時期的動脈粥樣硬化斑塊中轉(zhuǎn)染P4Hα1慢病毒,觀察P4Hα1對斑塊的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及易損性的影響。
(3)在分子生物學(xué)、組織學(xué)水平探討過表達(dá)P4Hα1作用的可能機(jī)制。
2.材料和方法
2.1、構(gòu)建含目的基因的病毒載體
由上海inventrogen公司用化學(xué)合成的方法合成目的基因P4Hα1并攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因的慢病毒載體(Lenti-P4Hα1),及僅攜帶增強(qiáng)型
8、綠色熒光蛋白報告基因但無目標(biāo)基因P4Hα1的陰性對照空病毒載體(Lenti-EGFP)。
2.2、構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型
購買北京大學(xué)維通利華動物技術(shù)公司的8周齡ApoE-/-雄性小鼠,全程高脂飲食(含0.25%膽固醇和15%脂肪)喂養(yǎng)。
2.2.1、構(gòu)建小鼠主動脈根部自發(fā)粥樣硬化斑塊模型
ApoE-/-雄性小鼠(8周齡,80只),全程高脂飲食(含0.25%膽固醇和15%脂肪
9、)喂養(yǎng)。隨機(jī)分為4組:10周齡組、12周齡組、14周齡組、16周齡組;每組20只。高脂喂養(yǎng)至10周齡、12周齡、14周齡、16周齡,行安樂死處死動物,取材檢測。見流程圖1.
2.2.2、構(gòu)建小鼠頸總動粥樣硬化斑塊模型
為誘發(fā)頸總動脈斑塊形成,8周齡ApoE-/-雄性小鼠行右側(cè)頸總動脈套管術(shù)?;蜣D(zhuǎn)染干預(yù)后并分別于套管術(shù)后4周(套管4周的斑塊)及12周(套管12周的斑塊)取材,進(jìn)行檢測。
頸動脈套
10、管和基因轉(zhuǎn)染流程
(1)頸動脈套管:8周齡ApoE-/-雄性小鼠行右側(cè)頸總動脈套管術(shù),用0.08%戊巴比妥鈉(40mg/Kg),術(shù)前行腹腔注射麻醉。將小鼠固定于手術(shù)臺,用脫毛劑給予頸部脫毛處理后,碘酒消毒。沿頸正中線小心地切開皮膚。分離腺體與肌肉,暴露氣管,將腺體上翻,清晰看到右側(cè)頸總動脈,小心分離,避免損傷伴行的迷走神經(jīng)。將預(yù)先剖開消毒處理的硅膠套管輕柔小心地套于頸總動脈上,絲線結(jié)扎固定套管?;謴?fù)組織結(jié)構(gòu)層次后,縫合皮膚
11、切口。
(2)基因轉(zhuǎn)染流程:
①套管4周的斑塊干預(yù)組:60只8周齡ApoE-/-雄性小鼠,右側(cè)頸動脈套管術(shù)后2周,隨機(jī)分為三個亞組:生理鹽水組(Mock組),空病毒組(Lenti-EGFP組)和P4Hα1組(Lenti-P4Hα1組),每組20只。分別小鼠尾靜脈注射20ml生理鹽水,空病毒(Lenti-EGFP,1.75×108Tfu/ml,20ul),攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因的慢病毒載體(Lenti-
12、P4Hα1,1.75×108Tfu/ml,20ul)的懸液。轉(zhuǎn)染2周行安樂死后取材。見流程圖2。
②套管12周的斑塊干預(yù)組:60只右側(cè)頸總動脈套管術(shù)后8周開始給予精神應(yīng)激刺激,刺激持續(xù)到術(shù)后12周。精神應(yīng)激刺激方法:將實(shí)驗(yàn)小鼠封閉于50ml大小、帶有通氣孔的塑料管中,給與強(qiáng)度為110dB的噪音刺激,噪音刺激間隔為5分鐘,每次持續(xù)3秒,每天持續(xù)6小時,共刺激四周到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。基因轉(zhuǎn)染:套管術(shù)后10周,所有實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為生理鹽
13、水組(Mock組),空病毒組(Lenti-EGFP組)和P4Hα1組(Lenti-P4Hα1組),每組20只。分別小鼠尾靜脈注射20ul生理鹽水,空病毒(Lenti-EGFP,1.75×108Tfu,20ul),攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因的慢病毒載體(Lenti-P4Hαl,1.75×108Tfu/ml,20ul)的懸液。轉(zhuǎn)染2周后予以安樂死后取材生理鹽水組。見流程圖3。
2.3、顯微超聲檢測斑塊:顯微超聲影像系統(tǒng)Ve
14、vo7700(RMV708探頭)分別于套管術(shù)后2周、10周轉(zhuǎn)染干預(yù)前和4周、12周安樂死前行套管側(cè)頸總動脈動脈粥樣硬化斑塊的血管超聲檢測。
2.4、體重及血液學(xué)指標(biāo)的檢測:分別于套管術(shù)后2周、10周轉(zhuǎn)染干預(yù)前和4周、12周安樂死前檢測小鼠體重;血脂水平;血清中羥脯氨酸水平。
2.5、組織學(xué)檢測:小心分離套管側(cè)頸總動脈,常規(guī)冰凍切片后,分別行蘇木素-伊紅、天狼猩紅、油紅O染色。使用Image-ProPlus6.
15、0圖像分析軟件測量斑塊面積、纖維帽面積、纖維帽厚度、纖維帽中膠原含量及脂質(zhì)核面積并計(jì)算易損指數(shù)。
2.6、免疫組化:
頸動脈組織冰凍切片漂洗后,常規(guī)行5%血清封閉,為檢測不同指標(biāo),分別行相應(yīng)的一抗二抗孵育:P4Hα1、MOMA-2,α-actin,Ⅰ型,Ⅲ型前膠原,Ⅰ型及Ⅲ型膠原,IL-6、TNFa、MCP-1、MMP9,MMP2,TIMP-1,TIMP-2。使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分
16、別計(jì)算以上不同指標(biāo)在相應(yīng)斑塊中的陽性染色面積(%)。
2.7、蛋白印跡檢測:
常規(guī)提取動脈斑塊的組織蛋白,行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育一抗二抗,發(fā)光。觀察目的蛋白P4Hα1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原、MMP2、MMP9、PTEN的相對表達(dá)變化。Quantity-one圖像分析軟件分析計(jì)算三組中各種不同的目的蛋白的相對含量。
2.8、實(shí)時定量檢測:收集主動脈根部或右側(cè)套管近心端頸總動脈各組斑塊組織,常規(guī)提取總的m
17、RNA,實(shí)時熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測各組斑塊干預(yù)后P4Hα1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)水平。
2.9、明膠酶譜法:檢測MMP2/MMP9的活性。常規(guī)方法分別制備10%分離膠、4%濃縮膠;在10%的分離膠中加入明膠儲存液,至終濃度為0.1%;然后常規(guī)上樣、電泳。取下電泳后的凝膠,放入100ml酶譜復(fù)性緩沖液(2.5%TritonX-100)中,室溫條件下振蕩30min;再在酶譜顯影緩沖液中平衡30min;將凝膠置于新
18、鮮的酶譜顯影緩沖液中,37℃過夜;凝膠染色、脫色;分析條帶大小并測定灰度;計(jì)算相對量的變化。
3.結(jié)果
3.1、實(shí)驗(yàn)動物一般情況
實(shí)驗(yàn)過程中生理鹽水組中1只小鼠死于麻醉,套管12周的斑塊P4Hα1組中1只小鼠死于轉(zhuǎn)染后第13天,解剖后發(fā)現(xiàn)明顯的肝硬化。余實(shí)驗(yàn)小鼠未觀察到局部和全身性的不良反應(yīng),均完成實(shí)驗(yàn)。套管4周的斑塊組中的3組,與套管12周的斑塊組中3組的ApoE-/-小鼠的體重、及血脂指標(biāo):
19、TC、TG、LDL-C和HDL-C的血清水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而套管4周的斑塊組與套管12周的斑塊組中P4Hα1組中血清羥脯氨酸水平顯著高于生理鹽水組與空病毒組。
3.2、顯微超聲檢測斑塊形成
小鼠顯微血管超聲檢測顯示,套管2周套管側(cè)頸動脈內(nèi)膜增厚,4周見小斑塊形成;10周、12周套管側(cè)的頸總動脈有明顯斑塊形成。而對側(cè)未套管的頸總動脈管腔光滑。
3.3、動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)染效率的檢測
20、 慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)于慢病毒轉(zhuǎn)染7天、10天、14天、21天、28天、35天后,分別取材,檢測粥樣硬化斑塊內(nèi)綠色熒光表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染14天P4Hα1組和空病毒組動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)GFP表達(dá)率最高(70%),而生理鹽水組的頸總動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)無GFP表達(dá)。證實(shí)體內(nèi)轉(zhuǎn)染有效。所以取慢病毒轉(zhuǎn)染2周取材作為本實(shí)驗(yàn)的慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)時間點(diǎn)。
3.4、過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊組織病理學(xué)的影響
(1)過表達(dá)P4H
21、α1對套管4周的斑塊中P4Hα1表達(dá)的影響
RT-PCR、Westernblot檢測及免疫組化染色顯示:三組比較,P4Hα1組P4Hα1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。
(2)過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊中內(nèi)膠原表達(dá)的影響RT-PCR、Westernblot檢測及免疫組化染色顯示:三組比較,Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA水平無顯著性差異(P>0.05);但P4Hα1組Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)顯著增
22、加(P<0.05)。
(3)過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊組份和易損指數(shù)的影響
病理學(xué)染色顯示:三組比較,P4Hα1組膠原含量、平滑肌細(xì)胞含量顯著增加(P<0.05);脂質(zhì)含量三組間無顯著性差異(P>0.05);P4Hα1組巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05);易損指數(shù)顯著顯著降低(P<0.05)。
(4)過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊纖維帽的影響
HE及天狼星紅染色顯示:三組
23、比較,P4Hα1組斑塊平均纖維帽厚度顯著性增厚(P<0.05);纖維帽面積顯著增大(P<0.05);纖維帽中膠原的含量顯著增多(P<0.05)。
(5)過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊形態(tài)學(xué)的影響
HE及油紅O染色顯示:三組比較,P4Hα1組斑塊的面積及主動脈表面AS病變范圍顯著增大(P<0.05)。
(6)過表達(dá)P4Hα1對套管4周的斑塊中PTEN的表達(dá)影響
免疫組化、Weste
24、rnblot顯示,P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較PTEN的陽性染色面積,及PTEN的蛋白相對表達(dá)量顯著性減少(P<0.05)。
3.5、過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊組織病理學(xué)的影響
(1)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊中P4Hα1表達(dá)的影響
RT-PCR、Westernblot檢測及免疫組化染色顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較P4Hα1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(
25、P<0.05)。
(2)P4Hα1過表達(dá)對套管12周的斑塊內(nèi)膠原表達(dá)的影響
RT-PCR、Westernblot檢測及免疫組化染色顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);三組間Ⅰ型和Ⅲ型前膠原(Ⅰ型和Ⅲ型膠原)的mRNA的表達(dá),及Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的蛋白表達(dá)均無顯著性差異(P>0.05)。
(3)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊組份和易損指數(shù)
26、的影響
病理學(xué)染色顯示:
①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較膠原含量顯著增加(P<0.05);
②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較平滑肌細(xì)胞含量顯著增加(P<0.05);
③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較脂質(zhì)含量三組間無顯著性差異(P>0.05)。
④P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05);
⑤P4
27、Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較易損指數(shù)顯著顯著降低(P<0.05);
(4)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊內(nèi)纖維帽的影響HE及天狼星紅染色顯示:
①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較平均纖維帽厚度顯著性增厚(P<0.05);
②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的纖維帽面積顯著增大(P<0.05);
③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的纖維帽中膠原的含
28、量顯著性增大(P<0.05);
(5)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊形態(tài)學(xué)的影響
①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的面積三組之間無顯著地差異(P>0.05);
②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較主動脈表面AS病變范圍三組之間無顯著地差異(P>0.05)。
(6)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊內(nèi)炎性因子的影響
斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a
29、和MCP-1的免疫組化染色顯示:
①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)IL-6陽性染色面積顯著性減小(P<0.05);
②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)TNF-a陽性染色面積顯著性減小(P<0.05);
③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)MCP-1陽性染色面積顯著性減小(P<0.05);
(7)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶表
30、達(dá)的影響斑塊內(nèi)MMP9、MMP2、TIMP-1、TIMP-2的免疫組化染色及Westernblot顯示:
①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)MMP9、MMP2的陽性染色面積顯著性減?。≒<0.05);相反,TIMP-1、TIMP-2的陽性染色面積顯著性增大(P<0.05);
②Westernblot顯示,P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較MMP9、MMP2的蛋白相對表達(dá)量顯著性減少(P<0.0
31、5);
③基質(zhì)金屬蛋白酶原位酶譜法檢測顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較MMP9、MMP2活性顯著性降低(P<0.05);
(8)過表達(dá)P4Hα1對套管12周的斑塊中PTEN的表達(dá)影響
①免疫組化顯示,三組中PTEN的陽性染色面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
②Westernblot顯示出相同的趨勢:三組中PTEN的蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
32、4.結(jié)論
(1)在ApoE-/-小鼠脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中,P4Hα1的表達(dá)逐漸減少。
(2)在ApoE-/-小鼠套管4周的斑塊及套管12周的斑塊中,過表達(dá)P4Hα1均能升高斑塊中膠原的含量,降低易損指數(shù),但在套管4周的斑塊模型中過表達(dá)P4Hα1卻促使斑塊增大和主動脈表面斑塊總負(fù)荷的增多。
(3)過表達(dá)P4Hα1促進(jìn)套管4周的斑塊的增大及主動脈表面斑塊總負(fù)荷的增多,與過表達(dá)P4Hα1抑制了PT
33、EN的表達(dá)有關(guān)。
論文Ⅱ
MicroRNA-124調(diào)控P4Hα1影響平滑肌細(xì)胞膠原合成的分子機(jī)制
1.背景
MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA分子,長度約為18-24個核苷酸,能夠特異地結(jié)合于靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR),干擾靶基因的翻譯或促進(jìn)靶基因mRNA的降解。從而抑制靶蛋白在體內(nèi)的表達(dá)。MicroRNA與其靶基因之間構(gòu)
34、成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系,每個MicroRNA可以調(diào)控多個靶基因,而多個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個靶基因。據(jù)推測,miRNA調(diào)節(jié)著人體內(nèi)約60%以上的基因,在人體細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。
研究表明,膠原的減少與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)。P4Hα1是膠原合成的限速酶,能使前膠原(procollagen)肽鏈上的脯氨酸羥化成為羥基脯氨酸,促進(jìn)膠原的成熟與分泌。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明,炎性因子
35、如IL-6通過MAPK和c-Jun分子通路,下調(diào)P4Hα1的表達(dá),降低動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性;TNFa通過影響轉(zhuǎn)錄因子Nono的甲基化等表觀遺傳學(xué)的調(diào)控而降低P4Hα1的表達(dá)。相反,脂連素則可以通過MAPK-AP1分子傳導(dǎo)通路上調(diào)P4Hα1的表達(dá),增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。但是動脈粥樣硬化斑塊中MicroRNA分子與調(diào)節(jié)膠原合成的關(guān)鍵酶P4Hα1的關(guān)系如何目前尚無相關(guān)的研究報道。
MicroRNA124(miR-12
36、4)最早在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的病理調(diào)控過程。以后,又發(fā)現(xiàn)其在動脈粥樣硬化性腹主動脈瘤中高表達(dá)。提示miR-124可能與動脈重構(gòu)過程中膠原的代謝有關(guān)。Micro.org.等多個MicroRNA應(yīng)用軟件均推測miR-124能特異的與P4Hα1的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,并且結(jié)合能低,P4Hα1是miR-124理論上的靶基因。那么miR-124是否在動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)揮作用?是否與斑塊的膠原代謝有關(guān)?能否調(diào)控
37、P4Hα1,能否進(jìn)一步影響膠原的合成?到目前為止尚無相關(guān)的報道。
本研究提出如下假說:
(1)miR-124在應(yīng)激條件下的動脈粥樣硬化斑塊與非應(yīng)激條件下的斑塊中的表達(dá)不同,在應(yīng)激條件下的粥樣硬化斑塊中表達(dá)上調(diào)。
(2)P4Hα1是miR-124特定的靶基因。在人主動脈平滑肌細(xì)胞中上調(diào)miR-124能特異的抑制P4Hα1蛋白的表達(dá),并進(jìn)一步降低Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。相反,抑制主動脈平滑肌細(xì)胞中miR
38、-124的表達(dá),促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。
研究目的
(1)觀察ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊應(yīng)激組與非應(yīng)激組中MicroRNA124(miR-124)與P4Hα1表達(dá)變化關(guān)系。
(2)驗(yàn)證miR-124能特異地結(jié)合于P4Hα13'端非翻譯區(qū),明確P4Hα1是miR-124作用靶基因的分子機(jī)制。
(3)探討miR-124是否能調(diào)節(jié)P4Hα1,進(jìn)而影響主動脈平滑肌細(xì)胞中膠原的成熟
39、和表達(dá)。
2.材料和方法
(1)構(gòu)建動脈粥樣硬化斑塊模型:動物來源和頸動脈套管術(shù)同論文一60只套管后8周的ApoE-/-小鼠,隨機(jī)分成兩組:
①應(yīng)激斑塊組:頸動脈套管術(shù)后給予脂多糖與應(yīng)激刺激以誘發(fā)斑塊中的炎癥反應(yīng),應(yīng)激刺激的方法同論文一。
②非應(yīng)激組:不給予脂多糖與應(yīng)激刺激,僅持續(xù)高脂喂養(yǎng)。見流程圖1。
(2)設(shè)計(jì)與合成miR-124特異性引物
miR-
40、124特異性引物的設(shè)計(jì)與合成由丹麥Exiqon公司提供(本公司不提供引物序列)。
(3)設(shè)計(jì)與合成miR-124特異性引物模擬物及抑制物
使用化學(xué)合成的方法合成miR-124mimics及miR-124inhibitors。由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司提供。
(4)構(gòu)建含有P4Hα1-3'-UTR的熒光素酶報告基因質(zhì)粒
分別構(gòu)建含有野生型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列3'-UTR
41、(P4Hα1-3'-UTR-WT)、突變型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列3'-UTR(P4Hα1-3'-UTR-MUT)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL3):pGL3-P4Hα1-3'-UTR-WT和pGL3-P4Hα1-3'-UTR-MUT。通過脂質(zhì)體2000和miR-124mimic共轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞,檢測熒光素酶熒光表達(dá)強(qiáng)度。驗(yàn)證軟件預(yù)測結(jié)果。明確miR-124與P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)特異的堿基互補(bǔ)結(jié)合序列。探討m
42、iR-124調(diào)控的下游靶基因P4Hα1的分子機(jī)制。
(5)miRNA提取和實(shí)時熒光定量qRT-PCR
提出頸動脈斑塊及人主動脈平滑肌細(xì)胞中總的MicroRNAs,通過qRT-PCR檢測miR-124在兩組斑塊中及主動脈平滑肌細(xì)胞不同干預(yù)組中的相對表達(dá)量。
(6)人主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)
原代人主動脈平滑肌細(xì)胞,購自美國Sciencell,應(yīng)用VSMC培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)至80-90%融合后
43、,傳代再培養(yǎng)。第4-8代平滑肌細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。
(7)人主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染與刺激
①miRNAs轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞
應(yīng)用脂質(zhì)體2000進(jìn)行miRNA(miR-con、miR-124mimics或miR-124inhibitor)轉(zhuǎn)染。具體步驟按GenePORTER2的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,轉(zhuǎn)染后37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h,更換為常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時,進(jìn)行
44、下一步檢測。
②TNFa刺激人主動脈平滑肌細(xì)胞
六孔板中平滑肌細(xì)胞的密度達(dá)到80%-90%時,按100ng/mlTNFa的劑量濃度,將TNFa加入到細(xì)胞培養(yǎng)基刺激平滑肌細(xì)胞,37℃,5%CO2溫箱中培養(yǎng)24小時后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
(8)生物信息軟件分析
應(yīng)用miRanda,TargetScan,RNAhybridandPicTar等著名的MicroRNA分析預(yù)測軟件,確定P4Hα1
45、是miR-124用的靶基因。并且miR-124是調(diào)控P4Hα1的MicroRNA分子之一。進(jìn)一步確定miR-124與P4Hα13'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3'-UTR)特異結(jié)合的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。
(9)免疫印跡(WesternBlot)檢測
同論文一
(10)細(xì)胞免疫熒光
人主動脈平滑肌細(xì)胞干預(yù)后,4%甲醛固定,PBS漂洗,常規(guī)行5%兔血清封閉,分別行抗P4Ha1的一抗及帶熒光標(biāo)記的二抗孵育(避光
46、),DAPI染核后,避光拍照,使用Image-ProPlus6.0圖像分析特異熒光的表達(dá)含量。
3.結(jié)果
3.1、P4Hα1在斑塊中的表達(dá)
P4Hα1在應(yīng)激組斑塊中的蛋白表達(dá)顯著低于非應(yīng)激組(P<0.05)。
3.2、miR-124在斑塊中的表達(dá)
miR-124在應(yīng)激組斑塊中的表達(dá)顯著高于非應(yīng)激組(P<0.05)。
3.3、P4Hα1在人主動脈平滑肌細(xì)胞
47、中的表達(dá)
P4Hα1在TNFa刺激組中的蛋白表達(dá)顯著低于無TNFa刺激組(P<0.05)。
3.4、miR-124在人主動脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)
qRT-PCR顯示,miR-124在TNFa刺激的人主動脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)是無TNFa刺激組的2.57倍(U6標(biāo)準(zhǔn)化后)。兩組間的差異有顯著性(P<0.05)。
3.5、生物信息軟件分析結(jié)果
P4Hα1(NM_000917)
48、是miR-124的理論靶基因,并且結(jié)合能低。miR-124與P4Hα1的結(jié)合位點(diǎn)位于P4Hα1基因的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的第834-841個堿基。此堿基序列位點(diǎn)在生物界的各物種之間有高度保守性。
3.6、miR-124對P4Hα1表達(dá)的影響
miR-124mimics轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞48小時后,P4Hα1的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前顯著降低(P<0.05)。miR-124inhibitors轉(zhuǎn)染人主動
49、脈平滑肌細(xì)胞后,TNFa再刺激主動脈平滑肌細(xì)胞24小時后的P4Hα1的蛋白表達(dá)量較無miR-124inhibitors預(yù)轉(zhuǎn)染組上調(diào)(P<0.05)。
3.7、miR-124通過與P4Hα1的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的結(jié)合位點(diǎn)的特異結(jié)合作用
miR-124mimics與含有野生型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列P4Hα13'-UTR(P4Hα1-WT)熒光素酶報告質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞48小時
50、后,熒光素?zé)晒獗磉_(dá)顯著地被抑制(P<0.05)。
3.8、miR-124對膠原的合成與成熟的影響
miR-124mimics轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞48小時后,膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前顯著減少(P<0.05)。miR-124inhibitors預(yù)轉(zhuǎn)染能使TNFa誘導(dǎo)人主動脈平滑肌細(xì)胞降低膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的作用部分地消失,差異具有顯著性(P<0.05)。
4.結(jié)論
(1)在應(yīng)激
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