以血管平滑肌細胞為靶標的抗動脈粥樣硬化功效成分篩選及其作用機制初探.pdf

1、血管平滑肌細胞(VSMCs)的異常增殖、遷移是引起心血管疾病的關鍵因素之一。抑制血管平滑肌細胞的增殖,維持血管功能正常,是進行血管疾病預防的重要措施之一。本課題以本實驗室獲得的體外培養(yǎng)人臍動脈血管平滑肌細胞,并以高濃度血清刺激細胞增殖建立其異常增殖模型,以傳統(tǒng)醫(yī)學中具有治療“血瘀”效果的多種天然產(chǎn)物的活性成分如女貞子的齊墩果酸、當歸的阿魏酸、決明子的1,8-二羥基蒽醌及山藥的薯蕷皂苷元和大豆苷元及其衍生物等為研究對象,觀察其活性成分對于

2、血管平滑肌細胞增殖、遷移與粘附等細胞行為的影響變化,并初步探索了其影響機制。
　　 用組織植塊貼壁法進行人臍動脈血管平滑肌細胞的體外原代和傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察血管平滑肌細胞的生長狀態(tài),確定其生長曲線,考馬斯亮藍R250染色觀察細胞形態(tài)。結(jié)果原代培養(yǎng)細胞經(jīng)三到四周的貼壁生長后遷移出植塊并鋪滿瓶底,生長狀態(tài)良好,在光鏡下觀察單個細胞呈長梭形,細胞束狀排列,呈現(xiàn)漩渦狀生長,生長匯合呈典型的“峰-谷”樣,具有典型的平滑肌細胞特征

3、。經(jīng)傳代培養(yǎng)至第5代,細胞生長特性未見異常改變。表明成功建立了人臍動脈血管平滑肌細胞系。
　　 以高濃度血清培養(yǎng)VSMC,刺激細胞增殖生長,建立了VSMC的增殖模型。結(jié)果顯示:高濃度血清培養(yǎng)VSMC引起單位面積內(nèi)細胞族簇生長,細胞數(shù)量顯著增加,細胞達1.02×106個,而未增殖的對照組為6.7×105個；細胞核染色明顯,反差增強；細胞總蛋白含量由對照組的6.216μg升高至10.964μg；BrdU對細胞DNA的摻入量由對照組的

4、0.776μg增加到增殖組的1.3691μg,有明顯的摻入增加；高濃度血清培養(yǎng)細胞48h后觀察到細胞開始進入對數(shù)期,增殖生長提前,具有增殖特性；細胞G0／G1期的細胞數(shù)減少,進入S期的細胞數(shù)則明顯增多,增殖指數(shù)達77.79％;增殖細胞的平面遷移能力明顯提高,增殖細胞組的遷移數(shù)目為未增殖組的11.428倍,遷移距離為未增殖組的4.140倍；增殖組的細胞與細胞外基質(zhì)蛋白粘附結(jié)合能力有所增加,與骨橋蛋白的粘附數(shù)目是未增殖組的2.042倍,與層

5、粘連蛋白的粘附數(shù)目是未增殖組的1.742倍。因此,高濃度血清培養(yǎng)細胞影響細胞行為,引起VSMC的增殖、遷移與粘附,可用于體外增殖模型的研究。
　　 研究了各功效成分對紅細胞溶血、血清氧化、組織脂質(zhì)過氧化及·OH、·O2-和DPPH自由基的清除和對Fe3+的還原能力。功效成分根據(jù)其分子結(jié)構的不同,其抗氧化效果側(cè)重不同。當歸的主要功效成分阿魏酸主要通過清除自由基及還原Fe3+表現(xiàn)其抗氧化能力。對·O2-和DPPH自由基清除的IC50

6、分別為119.33及4.57μg／mL；對Fe3+的相對還原能力是Vit C的2.118倍。女貞的功效成分齊墩果酸抑制紅細胞溶血和肝勻漿脂質(zhì)過氧化,IC50分別為277.72和213,.52μg／mL,對Fe3+還原能力是Vit C的2倍。山藥功效成分1,8-二羥基蒽醌抑制血清自氧化、清除·O2-、·OH自由基,其IC50分別為359.32、65.91和48.57μg／mL。決明子功效成分薯蕷皂苷元抑制紅細胞溶血和血清自氧化,其IC50

7、分別為197.50μg／mL和95.37μg／mL；清除·OH和DPPH自由基,IC50分別為19.17μg／mL和1.84μg／mL。表明各功效成分可能通過對自由基清除、金屬離子還原、蛋白結(jié)合等方式抑制脂質(zhì)過氧化、紅細胞溶血,降低血清自氧化,從而對血液氧化應激產(chǎn)生保護作用。
　　 從細胞形態(tài)、蛋白和DNA合成、細胞周期等方面研究了天然產(chǎn)物功效成分對VSMC增殖活性的抑制作用。功效成分影響細胞形態(tài),延緩細胞生長,但均不具有明顯細

8、胞毒性。在終濃度為100μmol／L時,阿魏酸、齊墩果酸、1,8-二羥基蒽醌和薯蕷皂苷元抑制細胞相對活力,抑制率分別56.101、72.317、57.036和54.154％；抑制VSMCs蛋白合成分別達57.519、75.924、60.559和54.396％；降低DNA合成,BrdU摻入量由對照組的1.613μg下降為1.204、1.210、1.445和1.2.75μg；阻抑細胞周期,使PI指數(shù)由對照組的77.79％下降為65.26、6

9、0.28、71.36和59.85％,結(jié)果表明各功效成分對血清誘導的平滑肌細胞增殖有較好的抑制作用。此外,功效成分有效抑制血清刺激的VSMCs遷移和與細胞外基質(zhì)蛋白的粘附。在濃度為100μmol／L時,阿魏酸、齊墩果酸組、1,8-二羥基蒽醌和薯蕷皂苷元對遷移細胞數(shù)目的抑制率分別達73.78、48.59、70.81和58.96％,同時對遷移距離的抑制率分別為67.69、70.90、59.36和62.56％,有效抑制血清刺激增殖的細胞遷移；對

10、與骨橋蛋白粘附細胞數(shù)的抑制率分別達29.231、48.308、53.231和56.923％；同時對與層粘連蛋白粘附細胞抑制率分別為51.104、54.2598、64.038和67.192％。結(jié)果表明功效成分有效抑制VSMCs的增殖、遷移和粘附等行為,提示具有抗動脈粥樣硬化作用。
　　 本實驗研究了修飾的大豆苷元衍生物在平滑肌細胞體內(nèi)的吸收代謝。大豆苷元衍生物DD1和DD2更易被血管平滑肌細胞吸收,48h時的吸收利用率分別達到71

11、.672％和61.435％,均優(yōu)于大豆苷元54.584％的吸收率；衍生物化合物在細胞內(nèi)被持續(xù)代謝為原藥,發(fā)揮其功效。對VSMC作用表明,大豆苷元衍生物濃度依賴性抑制VSMC增殖、遷移和粘附,沒有明顯細胞毒性。在100μmol／L時DD1、DD2及daidzein對VSMC增殖的抑制率分別可達84.47、68.53和66.35％；對遷移細胞數(shù)目的抑制率分別達58.52、54.07和49.63％；同時對遷移距離的抑制率分別為81.17、71

12、.43和63.64％；對與骨橋蛋白粘附的細胞數(shù)目抑制率分別達48.308、47.077和46.769％；對與層粘連蛋白黏附的細胞抑制率分別達67.823、64.038和57.413％。此外,大豆苷元衍生物影響血清刺激的增殖HUVSMC細胞周期,與增殖對照組相比,DD1、DD2和daidzein使G0／G1期細胞增多,S期細胞減少,增殖指數(shù)分別為54.31％、56.39％和70.91％,均低于增殖對照組的77.79％。實驗結(jié)果提示大豆苷元

13、及其衍生物可能通過對VSMCs的增殖遷移的抑制具有抗動脈粥樣硬化作用。
　　 對天然產(chǎn)物功效成分對VSMCs的NOS／NO調(diào)節(jié)作用進行了研究。結(jié)果表明,功效成分上調(diào)NOS相對活力,促進體系中NO的產(chǎn)生。在100μmol／L時,阿魏酸、齊墩果酸、1,8-二羥基蒽醌、薯蕷皂苷元組細胞中NO含量分別為20.749、31.797、18.624和16.250μmol／gprot,均高于對照組10.161μmol／gprot；NOS相對活力

14、分別為1.008、1.061、0.900和0.798U／mgprot,均高于對照組0.668U／mgprot。NOS酶活力作用順序與各組細胞中NO產(chǎn)生結(jié)果一致,均為:齊墩果酸>阿魏酸>1,8-二羥基蒽醌>薯蕷皂苷元,提示藥物對細胞NOS活力造成調(diào)節(jié),從而調(diào)節(jié)系統(tǒng)中NO的產(chǎn)生。
　　 為了觀察血清培養(yǎng)對血管平滑肌細胞增殖的影響及功效成分對其的調(diào)控,實驗采用real time PCR.檢測了增殖細胞中周期相關因子mRNA的表達情況,

15、初步探討功效成分對血管平滑肌細胞增殖的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清培養(yǎng)細胞引起細胞增殖,細胞中CDK2 mRNA表達增強,p27kip1 mRNA表達受抑。和血清刺激組相比,功效成分組細胞CDK2 mRNA的表達受抑,p27kiP1mRNA的表達增強。表明:功效成分可能通過下調(diào)周期蛋白依賴性激酶,上調(diào)激酶抑制蛋白的表達來進行調(diào)控周期進程,從而影響細胞增殖。提示,功效成分對可能增殖細胞周期相關因子的催化活性部分進行干預,而不造成調(diào)節(jié)蛋白的表達抑制