miR-146a對(duì)前列腺癌糖代謝功能影響的研究及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、前列腺癌是一個(gè)多病因且復(fù)雜的常見病，是威脅男性健康的常見腫瘤。在我國(guó)，隨著人口老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率逐年遞增。前列腺癌已成為威脅中國(guó)男性健康的主要疾病之一。近年來(lái)，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的分子生物學(xué)理論發(fā)生了重大變革，也使人們對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。在這個(gè)過程中，miRNA以其重要的診斷和治療價(jià)值給前列腺癌的研究帶來(lái)了新的曙光。
　　本課題組前期通過miRNAs芯片篩選發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常前列腺組織和雄激素依

2、賴性前列腺癌組織而言，去勢(shì)抵抗性前列腺癌組織中miR-146a的表達(dá)水平偏低，并且通過定量PCR手段在臨床前列腺癌切除標(biāo)本上驗(yàn)證了這一結(jié)果。后通過分析MSKCC數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性前列腺癌中miR-146a表達(dá)水平低于局限性癌，同時(shí)Gleason=8分癌組織中miR-146a表達(dá)水平低于Gleason＜8分的癌組織。并且癌組織低表達(dá)miR-146a的患者在根治手術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。我們通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-146a能夠抑制

3、前列腺癌的增殖、侵襲及遷移等生物學(xué)功能，以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力，并且抑制癌細(xì)胞的體外成瘤能力。糖酵解代謝作為前列腺癌細(xì)胞的重要代謝特征之一，其過程中的分子調(diào)控機(jī)制暫時(shí)不完全明確。且miR-146a分子對(duì)前列腺癌糖代謝功能的影響尚未有研究和定論。
　　在第一部分中，我們通過向前列腺癌細(xì)胞(PC3和DU145)內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-146a mimics后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ATP檢測(cè)、上清液乳酸生成量和葡萄糖濃度檢測(cè)、糖酵解速度檢測(cè)等手段檢測(cè)了mi

4、R-146a對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠降低前列腺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，同時(shí)降低細(xì)胞的ATP生成量，并且降低糖酵解代謝生成的乳酸量。通過XF96儀器檢測(cè)細(xì)胞外酸化速度發(fā)現(xiàn)miR-146a抑制了前列腺癌細(xì)胞的糖酵解能力。整理和分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE35988數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，己糖激酶2（HK2）在前列腺良性增生切除的標(biāo)本中的表達(dá)水平顯著性低于雄激素依賴性前列腺癌和去勢(shì)抵抗性前列腺癌，同時(shí)去勢(shì)抵抗性前列腺癌組織中

5、HK2的表達(dá)水平高于雄激素依賴性前列腺癌組織。在前列腺癌細(xì)胞中用siRNA下調(diào)HK2蛋白質(zhì)的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的ATP生成量減少，糖酵解產(chǎn)生的乳酸量下降，葡萄糖攝取能力下降，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞外酸化速度發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的糖酵解能力下降。我們通過熒光素酶報(bào)告基因及Western bloting證實(shí)HK2是miR-146a的靶基因，通過向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146a后恢復(fù)性表達(dá)HK2蛋白，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的葡萄糖攝取能力回升，同時(shí)糖酵解生成的乳酸量回升，ATP產(chǎn)

6、量回升，機(jī)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的糖酵解能力得到了恢復(fù)。由此我們證明在前列腺癌細(xì)胞中，miR-146a通過靶向下調(diào)HK2蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞糖酵解能力。
　　聯(lián)合本課題組的所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-146a的抑癌作用已被研究和證明。但miR-146a在前列腺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不十分明確，因此第二部分將研究重心放在了miR-146a的表達(dá)機(jī)制的調(diào)控上。
　　第二部分中，我們通過UCSC生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)了miR-146a轉(zhuǎn)錄因子YY

7、1。通過分析ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織的YY1表達(dá)水平高于正常前列腺組織，轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中YY1表達(dá)水平亦高于原位前列腺癌。分析Nakagawa上傳的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)且前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的患者癌組織中YY1的表達(dá)水平顯著高于非生化復(fù)發(fā)組，且YY1的表達(dá)水平隨著Gleason評(píng)分升高。我們選取45例臨床前列腺癌組織，利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)石蠟切片中YY1蛋白的表達(dá)，同時(shí)利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)石蠟切片中miR-146a分子的表

8、達(dá)，量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果后分析發(fā)現(xiàn)miR-146a與YY1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.007)。
　　通過敲低PC3細(xì)胞YY1表達(dá)后，提取細(xì)胞總RNA，測(cè)序獲得全轉(zhuǎn)錄組RNA數(shù)據(jù)，并通過基因探針富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)miR-146a靶基因RNA水平呈現(xiàn)了負(fù)向富集(NES=-1.039，F(xiàn)DR=0.267，P=0.15)，而EZH2抑制的基因集發(fā)生正向富集(NES=1.34，F(xiàn)DR=0.02，P=0.02)。同時(shí)通過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)

9、YY1表達(dá)后，miR-146a的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。
　　我們構(gòu)建miR-146a初始轉(zhuǎn)錄本上游序列報(bào)告基因質(zhì)粒(-1226～36bp)，通過熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了YY1對(duì)miR-146a的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)YY1和EZH2同時(shí)下調(diào)后miR-146a的表達(dá)進(jìn)一步升高。最后通過提取細(xì)胞核蛋白，實(shí)施蛋白質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了YY1聯(lián)合EZH2參與miR-146a的轉(zhuǎn)錄抑制過程。綜上第