BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤。2012年全世界前列腺癌新確診病例110萬，位居各瘤種第二位。在發(fā)達(dá)國(guó)家前列腺癌新發(fā)病例位居各瘤種首位，在發(fā)展中國(guó)家位居第4位。隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口老齡化和人們生活方式的改變，前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前，前列腺癌篩查、早期診斷、手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌和免疫治療等綜合診療模式使患者的死亡率逐漸降低，但仍有相當(dāng)一部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，需要不斷探索前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找潛在的干

2、預(yù)靶點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，離子通道在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。臨床上大約有13％的藥物都作用于離子通道，用于治療心血管和神經(jīng)系統(tǒng)異常等多種疾病。因此，探索將離子通道作為某些腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)或預(yù)測(cè)指標(biāo)具有重要的研究意義。
　　BKCa是廣泛表達(dá)于心肌、血管平滑肌、神經(jīng)系統(tǒng)等全身多種組織和器官的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道。BKCa在可興奮細(xì)胞中主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)，參與調(diào)控血管舒縮性和神經(jīng)興奮性等生理功能。近年來研究

3、發(fā)現(xiàn)，BKCa在多種腫瘤中呈高表達(dá)并參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等許多惡性生物學(xué)行為。BKCa的編碼基因在晚期前列腺癌中的擴(kuò)增率達(dá)16%，而在早期患者中無擴(kuò)增。目前研究發(fā)現(xiàn)，BKCa可以促進(jìn)前列腺癌的增殖，但其分子機(jī)制尚未完全闡明。此外，除細(xì)胞增殖外BKCa是否也參與了前列腺癌的轉(zhuǎn)移、BKCa在體外的促腫瘤作用是否也能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)這些問題均有待回答。本課題從前列腺癌細(xì)胞系、荷瘤裸鼠體內(nèi)和臨床腫瘤組織和三個(gè)層面檢測(cè)了BKCa的表達(dá)

4、和功能，初步探討了BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制。
　　第一部分 BKCa在前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)
　　目的：比較 BKCa在前列腺癌細(xì)胞和組織與正常細(xì)胞和癌旁良性組織中的表達(dá)差異，分析BKCa表達(dá)與前列腺癌臨床分期和腫瘤增殖標(biāo)志物Ki67的相關(guān)性。
　　方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)BKCa在前列腺癌細(xì)胞PC3和C4-2和

5、正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了前列腺癌組織與癌旁良性組織中BKCa的表達(dá)差異。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了前列腺癌組織中 BKCa的表達(dá)與腫瘤分期和Ki67表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：定量PCR和Western blot結(jié)果顯示BKCa的mRNA和蛋白質(zhì)在前列腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均高于癌旁良性組織和正常前列腺上皮細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果提示，BKCa在前列腺

6、癌組織中的表達(dá)與增殖標(biāo)志物 Ki67呈正相關(guān)，且BKCa的表達(dá)隨著前列腺癌分期的提高而增加，IV期前列腺癌中BKCa的表達(dá)明顯高于I-III期。
　　結(jié)論：BKCa在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁良性組織和正常上皮細(xì)胞，前列腺癌組織中BKCa與Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)，且腫瘤分期越晚BKCa表達(dá)越高。
　　第二部分 BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：探討B(tài)KCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影

7、響
　　方法：通過質(zhì)粒載體介導(dǎo)的 BKCa上調(diào)體系和慢病毒載體介導(dǎo)的 BKCa穩(wěn)定沉默體系實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺癌PC3和C4-2細(xì)胞系中BKCa表達(dá)的上、下調(diào)，并采用MTT、EdU、平板克隆、細(xì)胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) BKCa表達(dá)上、下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。采用前列腺癌PC3細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型和細(xì)胞尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型，檢測(cè) BKCa表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及腫瘤組織中Ki67的表達(dá)變化。

8、r>　　結(jié)果：BKCa表達(dá)上調(diào)后，前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、DNA合成效率和克隆形成能力較對(duì)照組明顯提高，細(xì)胞劃痕愈合率、遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量也較對(duì)照組顯著提高；BKCa表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制前列腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為。體內(nèi)研究顯示，BKCa表達(dá)下調(diào)后PC3細(xì)胞裸鼠種植瘤體積、質(zhì)量和Ki67表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，尾靜脈注射的PC3細(xì)胞肺臟轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯減少。
　　結(jié)論： BKCa表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；BKCa表

9、達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制前列腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為，并抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 BKCa調(diào)控前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　目的：探討B(tài)KCa調(diào)控前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　方法：采用膜片鉗技術(shù)驗(yàn)證BKCa激動(dòng)劑NS1619和抑制劑IBTX對(duì)PC3細(xì)胞鉀電流的作用，并檢測(cè) BKCa活性調(diào)節(jié)對(duì)前列腺癌增殖和遷移的影響。采用激光共聚焦免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)BKCa與整合素αvβ3和FAK的共定位和

10、相互作用情況，通過Western blot檢測(cè)BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)整合素αvβ3、FAK和p-FAK（Tyr397）表達(dá)的影響。采用整合素αvβ3封閉抗體LM609和FAK抑制劑Y15處理BKCa表達(dá)上調(diào)的 PC3細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移變化，驗(yàn)證整合素αvβ3/FAK通路在BKCa調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮的作用。采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)臨床前列腺癌標(biāo)本中的BKCa和p-FAK（Tyr397）表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：BKCa的

11、離子通透功能在促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮一定作用但并非主要機(jī)制。BKCa與整合素αvβ3和FAK存在共定位和相互作用，BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)整合素αvβ3和FAK的表達(dá)無影響，但可通過與整合素αvβ3和FAK形成功能復(fù)合體，加強(qiáng)后兩者間的信號(hào)偶聯(lián)從而增加FAK的磷酸化，最終促進(jìn)PC3細(xì)胞的增殖和遷移。阻斷αvβ3/ FAK信號(hào)通路后可明顯削弱BKCa表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。在臨床前列腺癌標(biāo)本中，BKCa和p-FAK（Tyr