KLF4與ATO通過調(diào)控Wnt信號通路在套細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制研究.pdf

1、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)來源于淋巴結(jié)濾泡外套B細(xì)胞異常增殖，以染色體t(11;14)(q13; q32)易位導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的過表達(dá)為特征，多見于老年男性，發(fā)展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，傳統(tǒng)化療后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后不佳，中位生存期僅為3-5年;因此積極探索疾病發(fā)病機(jī)制，尋找特異性腫瘤標(biāo)志物和有效靶向治療成為最具潛力的突破方向。
　　Krüppel樣因子(Krüppel-like factor, KLF)是一類在人類組織中廣

2、泛表達(dá)的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。KLF家族蛋白在許多不同的生理活動如細(xì)胞增殖、生長、分化和正常組織穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。KLF4基因包含3個結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和核定位序列。其中高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于羧基端，一般用來調(diào)節(jié)DNA結(jié)合的特異性;轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域位于氨基端，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用。KLF4在不同的腫瘤組織中可以通過與不同的靶基因作用，發(fā)揮促癌或者抑癌兩種完全相反的功能。KLF4在乳腺導(dǎo)管癌和口腔鱗癌

3、中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是癌基因;而在胃腸道腫瘤如食管鱗癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌，肺癌、膀胱癌、前列腺癌中表達(dá)減低發(fā)揮抑癌作用。在血液病研究中發(fā)現(xiàn)，KLF4在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和cHL中發(fā)揮抑癌基因的作用且常發(fā)生因基因啟動子甲基化導(dǎo)致的沉默。而KLF4在MCL中的表達(dá)水平及作用尚未有明確報道。
　　Wnt信號通路在B細(xì)胞的正常分化增殖中高度保守且具有重要意義，近期研究表明Wnt/β-catenin通路在MC

4、L中都處于異?；罨癄顟B(tài)，并與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。正常狀態(tài)下，β-catenin由GSK-3β等組成的復(fù)合物磷酸化降解并在細(xì)胞中保持低水平表達(dá)。細(xì)胞受到異常刺激時，GSK-3β組成的復(fù)合物活性受抑制，大量非磷酸化β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，β-catenin在細(xì)胞核中與TCF形成復(fù)合體使得下游如c-myc，cyclin D1，MMP7等與細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)基因異常激活，從而參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)報道KLF4

5、在胃腸道腫瘤中可通過抑制Wnt/β-catenin通路發(fā)揮抗腫瘤作用;在多能干細(xì)胞研究中KLF4與β-catenin協(xié)同誘導(dǎo)端粒酶催化亞單位的表達(dá)，從而參與細(xì)胞生長的調(diào)控。
　　砷劑早在古希臘和古代中國時期就被當(dāng)做藥物和毒藥使用。三氧化二砷(ATO)聯(lián)合口服維甲酸(ATRA)已經(jīng)成為初治非高危型APL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。ATO也開始在其他惡性血液病領(lǐng)域有進(jìn)一步的研究觀察。然而，在MCL中ATO的相關(guān)研究報道甚少。
　　DNA甲基

6、化是目前腫瘤研究中的熱點之一，大量研究表明腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在抑癌基因甲基化水平和模式的調(diào)控紊亂。由于DNA甲基化為可逆性調(diào)控，因此可以作為腫瘤靶向治療的重要研究調(diào)控方向。在胃腸道腫瘤及部分淋巴瘤中均有發(fā)現(xiàn)KLF4啟動子區(qū)域因甲基化而導(dǎo)致的基因沉默，提示KLF4啟動子甲基化可能與腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。
　　本研究應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及慢病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)基因過表達(dá)等技術(shù)，探討了KLF4與ATO通過調(diào)控Wnt信號通路在MCL疾

7、病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用及機(jī)制，為尋求新的分子標(biāo)志物和靶向治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。
　　第一部分:KLF4在套細(xì)胞淋巴瘤中調(diào)控機(jī)制研究
　　目的:
　　KLF4為鋅指蛋白類核轉(zhuǎn)錄因子，是多能干細(xì)胞(iPS)的誘導(dǎo)因子之一，可在不同腫瘤中與不同的靶基因相互作用發(fā)揮抑癌或促癌作用。KLF4隨B細(xì)胞成熟度增高而表達(dá)升高，在多種血液腫瘤中發(fā)現(xiàn)表達(dá)減低、缺失。有研究表明KLF4在血液惡性疾病中的作用仍存在爭議。套細(xì)胞淋巴瘤來源于淋

8、巴結(jié)濾泡外套B細(xì)胞異常增殖，發(fā)展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，預(yù)后不佳，因此積極探索疾病發(fā)病機(jī)制，尋找腫瘤標(biāo)志物和有效靶向治療成為最具潛力的突破方向。本研究旨在探討KLF4在套細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)及其影響因素，及對Wnt信號通路的調(diào)控和機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和切片組織標(biāo)本收集;
　　2.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR;
　　3.免疫組織化學(xué)染色;
　　4.蛋白提取和western blot分析;

9、>　　5.慢病毒載體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)MCL細(xì)胞株KLF4過表達(dá);
　　6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，CCK8法檢測細(xì)胞增殖;;
　　7.免疫沉淀(IP)法檢測KLF4與β-catenin結(jié)合情況;
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過實時定量PCR、western blot結(jié)果分析，與健康志愿者相比較，套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（Jeko-1，Mino，SP53）中KLF4 mRNA、蛋白表達(dá)均明顯減低。免疫組化分

10、析顯示套細(xì)胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織石蠟標(biāo)本中KLF4表達(dá)水平均減低，且其表達(dá)水平與套細(xì)胞淋巴瘤患者分期密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　2.通過western blot結(jié)果分析，套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jeko-1，Mino，SP53中β-catenin、c-myc、cyclin D1的蛋白表達(dá)與健康志愿者相比明顯升高。免疫組化結(jié)果分析套細(xì)胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織標(biāo)本中KLF4表達(dá)水平與β-catenin表達(dá)水平相關(guān)(P＜0.05)。

11、　　3.流式細(xì)胞儀檢測分析顯示，慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)KLF4的Jeko-1細(xì)胞凋亡增加，CCK8法檢測KLF4過表達(dá)Jeko-1細(xì)胞增殖受抑制，上述細(xì)胞株中β-catenin、c-myc表達(dá)下調(diào)，IP結(jié)果表明KLF4與β-catenin發(fā)生了蛋白結(jié)合。
　　4.通過western blot、免疫組化結(jié)果分析，套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(Jeko-1，Mino，SP53)以及套細(xì)胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織石蠟標(biāo)本中DNMT-1表達(dá)水平與正常對照標(biāo)本

12、相比均增高。去甲基化藥物5-azaC處理Jeko-1，Mino細(xì)胞后，去甲基化轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT-1)表達(dá)受抑制，而KLF4表達(dá)水平升高，Wnt/β-catenin通路分子表達(dá)受抑制。
　　結(jié)論:
　　本研究表明KLF4在套細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)水平與患者疾病分期密切相關(guān)，KLF4過表達(dá)可抑制β-catenin及其下游分子cyclinD1，c-myc的表達(dá)，通過免疫沉淀的研究證明KLF4表達(dá)增高后與β-catenin結(jié)合，使其

13、不能進(jìn)一步激活下游通路，是其發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一。DNMT-1在套細(xì)胞淋巴瘤組織及細(xì)胞株內(nèi)高表達(dá)，去甲基化藥物可促使KLF4恢復(fù)表達(dá)，且抑制Wnt通路相關(guān)分子，說明KLF4基因在套細(xì)胞淋巴瘤中可能因基因甲基化沉默。KLF4的表達(dá)水平、原因分析及作用機(jī)制研究對探索套細(xì)胞淋巴瘤的致病機(jī)制有重要意義。
　　第二部分:亞砷酸在套細(xì)胞淋巴瘤中通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路和DNMT-1發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制研究
　　目的:

14、r>　　亞砷酸(ATO)已成為治療急性早幼粒白血病標(biāo)準(zhǔn)方案藥物之一，并在其它惡性血液病領(lǐng)域也有進(jìn)一步的探討研究。套細(xì)胞淋巴瘤是淋巴結(jié)濾泡外套B細(xì)胞異常增殖起源的非霍奇金淋巴瘤，病情進(jìn)展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，預(yù)后不佳，因此積極探索疾病發(fā)病機(jī)制，尋找有效的抗腫瘤藥物成為重點研究方向。本研究旨在評估ATO在套細(xì)胞淋巴瘤中的抗腫瘤作用及并進(jìn)一步研究ATO相關(guān)作用的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和切片組織標(biāo)本收集;

15、r>　　2.免疫組織化學(xué)染色;
　　3.蛋白提取和western blot分析;
　　4.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR;
　　5.ATO、5-azaC、LiCl按照所需藥物濃度處理培養(yǎng)細(xì)胞;
　　6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.CCK8檢測及流式分析結(jié)果顯示ATO對套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jeko-1，Mino有顯著的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，效果隨藥物濃度

16、升高更顯著。
　　2.通過western blot、免疫組化結(jié)果分析，套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(Jeko-1，Mino，SP53、Grant519)中β-catenin、c-myc、DNMT-1的蛋白表達(dá)與健康志愿者相比較均明顯上調(diào)(P＜0.05)。生存分析顯示DNMT-1陽性表達(dá)的套細(xì)胞淋巴瘤患者在39個月前的生存率明顯低于陰性患者。
　　3.不同濃度ATO處理套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(Jeko-1，Mino，SP53)后，weste

17、rn blot及實時定量PCR分析顯示ATO可抑制細(xì)胞中DNMT-1和Wnt通路中β-catenin、及下游分子c-myc、cyclin D1、MMP7的表達(dá)，且抑制作用有劑量依賴性。
　　4.Western blot結(jié)果分析顯示ATO可以抑制由套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株細(xì)胞中LiCl刺激引起的β-catenin升高，并與5-azaC對DNMT-1的抑制有協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　本研究表明ATO在套細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮腫瘤抑制