可注射式多元RADA肽凝膠的構建及其成骨性能的研究.pdf

1、目的:
　　本課題希望構建可注射式多重生物活性因子控釋凝膠，由RADA肽(arginine[R]-alanine[A]-aspartate[D]-alanine[A])凝膠和納米羥基磷灰石（nano-Hydroxyapatite，nHA）構成支架，聚乳酸-乙醇酸納米顆粒(Poly Lactic-co-Glycolic Acid Nanoparticle，PLGA-NP)包裹重組人骨形成蛋白-2（Reconstruction hum

2、an Bone Morphogenetic Protein-2，rhBMP-2）構成緩釋細胞因子;人牙周膜干細胞(human Periodontal Ligament Stem Cells，hPDLSCs)構成種子細胞。以期通過復合支架材料中rhBMP-2的緩釋有效誘導hPDLSCs向成骨細胞方向分化，并通過可注射式材料提高支架的塑形能力。
　　方法:
　　1)選擇正畸過程中因治療需要拔除的青少年第一前磨牙，收集牙周膜，進行

3、原代細胞培養(yǎng)，并通過分離培養(yǎng)得到hPDLSCs，通過免疫熒光鑒定OCT4(Octamer-binding protein4)表達;流式鑒定hPDLSCs的相關因子表達，確定獲得的hPDLSCs可用于后續(xù)研究。
　　2)以rhBMP-2為模型藥，以PLGA為載體材料，制備得到載rhBMP-2的PLGA納米顆粒，通過電鏡檢測其粒子形態(tài)，并對其粒徑的大小和分布進行測定，ELISA試劑盒檢測rhBMP-2的緩釋參數(shù);探索RADA多肽觸發(fā)條

4、件的優(yōu)化方案，篩選RADA膠凝的最佳條件。最后進行BMP-2、BMP-2/PLGA-NP，BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA釋放率的測定。
　　3)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs共培養(yǎng)觀察細胞的成骨情況:7d檢測堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP

5、)的活性;14d進行茜素紅染色;分別于第7d和14d收取樣本進行檢測和比較兩個成骨標志基因ALP和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)經(jīng)不同處理后的表達水平。
　　4)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs共培養(yǎng)后注射進入裸鼠體內，4周后進行檢測成骨情況。Micro-CT掃描檢測不同分組之間的差異

6、。將小鼠處死后取組織進行HE染色觀察組織的病理變化，觀察到成骨現(xiàn)象后進行茜素紅檢測。RT-PCR檢測成骨標志基因ALP和OCN的表達。
　　結果:
　　1)經(jīng)有限稀釋法分離培養(yǎng)獲得的細胞，經(jīng)顯微鏡觀察呈多角型或梭型。對該類細胞的表面標志物進行檢測:利用免疫熒光染色方法檢測OCT4的表達，細胞發(fā)出明亮的紅色熒光，OCT4陽性表達，提示該細胞具備干細胞特性;流式細胞儀檢測顯示細胞CD7表達量為93.1％、CD90表達量為95.7

7、％、CD105表達量為94.8％，均為陽性，而CD34、CD45和CD79a表達則呈陰性。
　　2)在透射電鏡下，載BMP-2的PLGA納米顆粒呈現(xiàn)為球形，粒徑的分布相對較為均勻;激光粒度儀測定結果顯示，其粒徑約為100nm，pdi為0.231。經(jīng)載藥量測定BMP-2/PLGA-NP中BMP-2包載量為835ng，每毫克凍干粉含BMP-2約20.27ng，包封率約為17％。采用單因素考察篩選RADA的觸發(fā)條件，確定了RADA凝膠觸

8、發(fā)的最佳條件為:RADA濃度1％，觸發(fā)劑0.5％Tris，觸發(fā)時間0.25h時。該條件下可以使RADA膠凝，有一定的彈性，并具有固定的形態(tài)，不具有流動性。BMP-2、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA在透析袋內的釋放情況表明:PLGA有明顯的藥物緩釋功能，RADA凝膠對藥劑成分的擴散也有明顯的阻滯作用，但他們單獨作用時都不足以讓BMP-2對牙周膜干細胞的生長產(chǎn)生持續(xù)性的促進作用。將二者

9、結合，即將BMP-2包裹至PLGA納米粒后再分散至RADA凝膠中，使納米粒在靜態(tài)環(huán)境中更加緩慢地釋放藥物，疊加凝膠的阻滯擴散作用，最終使得BMP-2的緩釋作用超過21d。
　　3)RADA和hPDLSCs共培養(yǎng)14d后，細胞未見明顯的成骨分化:nHA對PDLSCs向成骨細胞分化有一定的促進作用。BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA與hPDLSCs共培養(yǎng)后均能

10、使hPDLSCs向成骨方向誘導分化，誘導14d后觀察BMP-2/PLGA-NP組、BMP-2/PLGA-NP/RADA組和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組都能明顯地觀察到成骨現(xiàn)象。ALP檢測發(fā)現(xiàn)，RADA凝膠并不能提高ALP的活性;BMP-2/PLGA-NP組、BMP-2/PLGA-NP/RADA組ALP活性增強，與RADA組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組ALP活性增加

11、最為明顯，與RADA組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。在第14d的茜素紅檢測中發(fā)現(xiàn)，BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA染色后礦化結節(jié)最明顯，nHA組有少量礦化結節(jié)，而RADA組無法觀察到。對成骨標志基因ALP、OCN表達水平的檢測結果顯示，經(jīng)RADA凝膠處理后ALP、OCN表達量均沒有明顯升高，較PDLSCs組差異沒有統(tǒng)計學意義，而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-N

12、P/RADA/nHA組ALP、OCN的表達量明顯升高，其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組最高，三組較PDLSCs組差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　4)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs混合后接種于裸鼠背部，4周后Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)，BMP-2/PLGA-NP、BMP-

13、2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA能夠觀察到較為致密的組織形態(tài);各實驗組通過HE染色和茜素紅染色都能夠明顯觀察到有類似成骨組織和礦化結節(jié)。植入hPDLSCs+RADA凝膠的裸鼠中ALP和OCN表達量與接種hPDLSCs細胞組沒有差異;而其他各組注射后裸鼠4周后OCN和ALP基因表達量均明顯提高(p＜0.01)。而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA

14、-NP/RADA/nHA組ALP、OCN表達量明顯升高，其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組最高，三組較PDLSCs組差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　結論:
　　本研究成功構建了多元RADA肽凝膠支架復合體，該復合體可以以溶液形式注射給藥，到達給藥部位后通過離子化膠凝機制形成凝膠支架。該支架可以為hPDLSCs提供三維生長環(huán)境。同時在該支架內，生物可降解的PLGA納米?？梢跃徛尫臖MP-2，與nHA