促進(jìn)骨形成的骨修復(fù)材料的構(gòu)建及其性能評價.pdf

1、由于先天性的和創(chuàng)傷性的原因，我國有大量的骨缺損患者，這其中不少患者屬于大塊骨缺損，靠自身能力不能完全修復(fù)，需要植入骨修復(fù)材料。因此，構(gòu)建具有優(yōu)異骨修復(fù)功能的骨修復(fù)替代材料不僅完全必要，而且十分迫切的。為此，我們選用一種新型促進(jìn)成骨化合物并復(fù)合于合適的載體構(gòu)建新型骨修復(fù)材料并對其骨修復(fù)性能進(jìn)行評價。 當(dāng)前在促進(jìn)骨修復(fù)的眾多細(xì)胞因子研究中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogenetic Proteins，BMPs)最具代表性。然

2、而，在應(yīng)用方面，BMPs作為活性蛋白分子，由于植入部位存在易分解、易丟失、作用短效、異體(種)蛋白排斥反應(yīng)等局限，直至目前仍無商品化的、效果可靠的骨誘導(dǎo)因子可供臨床選擇。即使目前現(xiàn)有的實驗用BMPs，價格也十分昂貴。鑒于此，研究者一直尋找具有骨修復(fù)作用的新的化合物，去鐵敏(Desferrioxamine，DFO)是我們最近篩選出來的具有強(qiáng)大促進(jìn)骨修復(fù)作用的化合物。其主要作用機(jī)制是抑制低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-InducibleFac

3、tor-1α，HIF-1α)的降解，而HIF-1α通過誘導(dǎo)促血管生成因子表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合過程中血管生成。同時HIF-1α還參與對骨系細(xì)胞功能的調(diào)控促進(jìn)骨形成。我們從7種抑制HIF降解的小分子化合物中篩選出成骨性能最強(qiáng)的DFO，我們體外實驗證實DFO在U20S-HRE-LUC細(xì)胞中，可上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子反應(yīng)元件(HRE)的表達(dá)，在基質(zhì)干細(xì)胞中(MSCs)中可升高HIF-1α水平，促進(jìn)VEGF表達(dá)，胎鼠跖骨體外培養(yǎng)中，周圍有大量血管生成。前

4、期已有動物實驗證實，在牽張成骨和骨折愈合的動物模型中局部應(yīng)用DFO科取得滿意的修復(fù)效果。 骨修復(fù)材料的構(gòu)建還需要合適的載體，在前期研究的基礎(chǔ)上，我們選擇煅燒骨(True Bone Ceramic，TBC)作為載體，與其它載體材料相比，TBC有如下優(yōu)點：保持了自然松質(zhì)骨的海綿狀結(jié)構(gòu)，且具有很好的空隙率；由骨礦物質(zhì)結(jié)晶組成，鈣磷比接近正常骨；良好生物相容性和骨傳導(dǎo)性。我們摸索出合適的濃度的DFO復(fù)合于TBC構(gòu)建生物活性新型組織工程化

5、骨—DFO-TBC，對DFO的釋放速度和骨修復(fù)性能進(jìn)行研究。針對這種材料設(shè)計，我們進(jìn)行了以下5個實驗研究。 一、TBC作為骨移植材料的相關(guān)研究 探索制備一種新的植骨材料一鍛燒牛松質(zhì)骨，并研究其理化性能和生物相容性。方法：將新鮮小牛骨制成條狀，經(jīng)煮沸及在氫氧化鈉、雙氧水中浸泡初步脫脂脫蛋白，干燥后入鍛燒爐緩慢鍛燒爐，即制得鍛燒牛松質(zhì)骨。用液體靜力承重法測定氣孔率，掃描電鏡測定孔徑，材料測試機(jī)測抗壓抗折強(qiáng)度，X線衍射測材料成

6、分。通過溶血試驗、微核試驗、全身急性毒性試驗、局部刺激試驗、熱源檢測試驗、體內(nèi)植入試驗等了解材料的生物相容性。結(jié)果顯示電鏡下材料微孔互相交通，孔徑250-450μm，孔隙率約為76％，X線衍射分析表明鈣磷約比1.75，接近正常骨，抗壓和抗折載荷分別為83.4±10.6N和89.2+9.7N。材料溶血率為0.521％，在允許范圍，微核試驗陰性，全身急性毒性試驗結(jié)果無異常，局部刺激試驗注射部位無水腫紅斑出現(xiàn)、熱源檢測試驗結(jié)果符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。研

7、究表明鍛燒牛松質(zhì)骨具有一定的強(qiáng)度，合適的孔徑，微孔互相交通，有可靠的生物安全性，可作為植骨材料，用于臨床。 二、TBC對DFO緩釋作用的體外實驗研究 為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體外緩釋作用，探討DFO-TBC復(fù)合物的藥物釋放動力學(xué)，將DFO以I125標(biāo)記，以單純TBC為對照組，以按TBC配比2倍體積5mM DFO的配比將TBC與DFO復(fù)合作為實驗組。將DFO-TBC樣條浸入0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，分

8、別在第1，2，3，4，5，6，7，14，30，60天取緩釋液，用gamma計數(shù)儀分析不同時間的標(biāo)本中的DFO緩釋量，繪制DFO緩釋曲線，總結(jié)藥物釋放動力學(xué)規(guī)律。結(jié)果顯示：第1～14天，DFO出現(xiàn)快速釋放，釋放曲線呈快速上升直線。第14～30天，DFO釋放處于平臺期，釋放曲線接近一水平直線。第30～60天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放，釋放曲線表現(xiàn)為上升之曲線.DFO的50％釋放時間為10.5天，其1，3，5，7，14，30和60天的釋放率為

9、7.71％，19.19％，26.37％，34.67％，67.20％，85.99％和99.99％。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體外緩釋作用，有望充當(dāng)DFO的緩釋載體，但緩釋速度尚有待提高。 三、TBC對DFO的緩釋作用的體內(nèi)實驗研究： 為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體內(nèi)緩釋作用，探討DFO-TBC復(fù)合物在體內(nèi)緩釋DFO的藥物釋放動力學(xué)，將DFO以I125標(biāo)記，以單純TBC為對照組，以按TBC配比2倍體積5mM

10、DFO的配比將TBC與DFO復(fù)合作為實驗組。將DFO-TBC樣條經(jīng)過手術(shù)置入兔的右側(cè)橈骨中段內(nèi)，分別在第1，2，3，4，5，6，7，14，30和60天手術(shù)取材，用gamma計數(shù)儀分析不同時間的標(biāo)本中的DFO殘留量，計算出DFO緩釋量，繪制DFO緩釋曲線，總結(jié)藥物釋放動力學(xué)規(guī)律，并與體外緩釋實驗結(jié)果比較。結(jié)果顯示：第1～14天DFO出現(xiàn)快速釋放，釋放曲線呈快速上升直線。第14～30天DFO釋放處于平臺期，釋放曲線接近一水平直線。第30～6

11、0天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放，釋放曲線表現(xiàn)為上升支曲線。DFO的50％釋放時間為9.5天，其第1，3，5，7，14，30和60天釋放量分別是8.17％、20.18％，27.00％，36.68％，70.32％，88.09％和99.99％。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體內(nèi)緩釋作用，且緩釋速度較體外有較大增快，有望充當(dāng)DFO的緩釋載體。 四、DFO-TBC的肌肉植入實驗研究 為了研究DFO-TBC植入動物體的成骨生物學(xué)

12、行為，為進(jìn)一步進(jìn)行DFO-TBC用于骨填充的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和方法積累，按TBC配比2倍體積5mM DFO的比例將TBC與DFO復(fù)合成DFO-TBC，經(jīng)手術(shù)植入于昆明小鼠臀部肌肉袋中。定期取材進(jìn)行大體觀察、組織切片，觀察材料表面變化、周圍組織有無感染等不良反應(yīng)、有無骨形成和生物力學(xué)指標(biāo)最大抗壓強(qiáng)度的改變。結(jié)果顯示植入后的TBC在體內(nèi)逐漸出現(xiàn)降解，60天時非常明顯。組織切片發(fā)現(xiàn)無新骨生成，最大抗壓強(qiáng)度持續(xù)減低。DFO-TBC植入后可

13、見大量新骨形成，最大抗壓強(qiáng)度持續(xù)升高，60天時升高132.04％。提示：DFO-TBC植入小鼠肌肉內(nèi)未見感染等不良反應(yīng)，可見骨形成，生物力學(xué)強(qiáng)度升高，有較好的連續(xù)性。 五、DFO-TBC修復(fù)大塊骨缺損的實驗研究 為了研究DFO-TBC植入動物骨內(nèi)DFO-TBC的降解和新骨替代行為，為將DFO-TBC用于骨填充的研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，按TBC配比2倍體積5mM DFO的配比將TBC與DFO復(fù)合成DFO-TBC，經(jīng)手術(shù)

14、植入于兔橈骨中段臨界性骨缺損中。術(shù)后定期取材進(jìn)行大體觀察、X線片和組織切片，觀察材料降解和被新骨替代的速度。結(jié)果顯示植入后的DFO-TBC在體內(nèi)降解和被新骨替代較單純TBC明顯加快，DFO-TBC植入后30天時X線片影像邊緣明顯不清，有骨痂樣影，60天時輪廓幾近消失。TBC植入后30天密度減低，但仍然外形清楚。組織切片顯示60天后DFO-TBC中間大量新骨形成，而TBC在60天后的降解和被新骨替代只有相當(dāng)于DFO-TBC在30天以內(nèi)的水

15、平。提示：DFO-TBC植入兔橈骨中段缺損后，其材料降解和被新骨替代明顯加快，且二者始終結(jié)合緊密。DFO-TBC是較單純TBC有明顯改進(jìn)的新型生物活性骨修復(fù)材料。 總結(jié)以上實驗結(jié)果，可以得知：TBC有較好的生物力學(xué)強(qiáng)度、微孔結(jié)構(gòu)等理化性能。TBC在體外和體內(nèi)均有DFO的多孔緩釋載體的特性，且在體內(nèi)的緩釋速度較體外明顯加快；DFO-TBC植入小鼠肌肉內(nèi)能誘導(dǎo)骨形成，在修復(fù)骨缺損試驗中能明顯加快新骨的生成、長入和材料的降解。DFO-