打靶于CREPT的microRNA的篩選及功能研究.pdf

1、miRNAs是一類內(nèi)源性的RNA，是一系列短的、由20-22個(gè)核苷酸組成的非編碼的核酸，可以通過(guò)影響靶mRNA穩(wěn)定性或者翻譯過(guò)程，進(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡有著至關(guān)重要的關(guān)系。miRNAs靶向作用于腫瘤相關(guān)基因，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)其衰老、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖等。CREPT是新發(fā)現(xiàn)一種癌基因，其在多種腫瘤組織中存在高表達(dá)，有望成為新的治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于CREPT早期研究?jī)H集中于該蛋白在腫瘤

2、發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中對(duì)下游基因調(diào)控機(jī)制的研究和蛋白晶體結(jié)構(gòu)的揭示，側(cè)重于CREPT蛋白下游生物學(xué)功能探討，而CREPT基因本身表達(dá)水平在腫瘤組織中升高的分子機(jī)制尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)以人類結(jié)直腸癌細(xì)胞株中CREPT mRNA分子為治療靶點(diǎn)，通過(guò)Target Scan和miRanda等打靶軟件預(yù)測(cè)靶向于CREPT mRNA的miRNAs，并通過(guò)查閱文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，篩選出打靶于CREPT mRNA的miRNA，即為miR-19

3、4。通過(guò)雙熒光酶素報(bào)告基因表達(dá)活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出miR-194與CREPT mRNA3’-UTR的精確結(jié)合位點(diǎn)，并用Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究了miR-194對(duì)CREPT蛋白水平表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果。
　　通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了miR-194對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116β/W生長(zhǎng)、增殖、克隆形成能力的影響。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)miR-194對(duì)細(xì)胞周期的影響進(jìn)行探究。結(jié)果表明，miR-194打

4、靶于CREPT后，可以抑制HCT116β/W生長(zhǎng)和增殖，調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯于S期。通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究miR-194對(duì)細(xì)胞周期及對(duì)信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，miR-194靶向于CREPT后，對(duì)Wnt信號(hào)通路有一定的抑制作用。miR-194打靶于CREPT后，可調(diào)節(jié)CREPT下游靶標(biāo)基因，CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin E、C-myc周期相關(guān)蛋白表達(dá)降低，調(diào)控細(xì)胞周期。NF-κB p65蛋白表