microRNA在男性不育中的功能研究.pdf

1、近年來(lái)，不育已儼然成為困擾全球范圍無(wú)數(shù)育齡家庭的嚴(yán)峻問(wèn)題。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，適齡夫妻未采取避孕手段一年時(shí)間仍不能受孕則定義為不育。有數(shù)據(jù)顯示，10％-15％的家庭不能通過(guò)自然方式受孕，其中男性不育因素占到一半。盡管部分男性不育是由于已知原因造成，如生殖道感染，隱睪，精索靜脈曲張，輸精管堵塞，性功能障礙等等，但是多數(shù)的男性不育都被診斷為未知原因的非梗阻性無(wú)精癥(NOA)。而且，NOA病人具有較低的精子獲取率，臨床受孕率以及更高的精子DNA損

2、傷率。因此，開展研究NOA的發(fā)病機(jī)理和潛在的分子機(jī)制能為臨床治療NOA患者提供方向和指導(dǎo)意見(jiàn)。
　　精子發(fā)生是一個(gè)精密調(diào)控的生理過(guò)程，發(fā)生在睪丸內(nèi)的曲細(xì)精管，主要包括從未分化的精原干細(xì)胞發(fā)育至高度分化的成熟精子細(xì)胞的過(guò)程，包括進(jìn)行有絲分裂的精原細(xì)胞以及進(jìn)行減數(shù)分裂的精母細(xì)胞。在精子發(fā)生后期，減數(shù)分裂之后轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。轉(zhuǎn)錄形成的mRNA主要是受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其中很重要的因子即是microRNA(miRNA)。miRNA即微小RN

3、A，是一段由19-23個(gè)核苷酸序列組成的非編碼RNA，通過(guò)自身的種子序列(Seed sequence)與其靶基因的3端非編碼區(qū)域(UTR)進(jìn)行完全或不完全配對(duì)結(jié)合，降解其靶基因的mRNA或抑制靶基因翻譯的方式來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控。
　　大量證據(jù)顯示，具有較高的DNA損傷的生殖細(xì)胞導(dǎo)致生精過(guò)程的受損，進(jìn)而造成男性不育。我們研究組先前的小分子RNA芯片(micro-array)結(jié)果顯示，microRNA-383(miR-383)在精子

4、成熟抑制(MA)病人睪丸組織中呈顯著下調(diào)，并且通過(guò)原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了miR-383主要定位表達(dá)于精子發(fā)生早期的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞。而早期生精細(xì)胞由于有絲分裂和減數(shù)分裂，重組染色體，具有DNA損傷的較高風(fēng)險(xiǎn)。然而，miR-383是否參與調(diào)控在精子發(fā)生過(guò)程中的DNA損傷，以何種形式調(diào)控？本論文的首要目的就是闡明miR-383在精子發(fā)生過(guò)程中DNA損傷的調(diào)控機(jī)理和分子機(jī)制。首先我們通過(guò)NOA患者睪丸組織鋪展發(fā)現(xiàn)，NOA

5、患者睪丸組織的DNA損傷率是正常對(duì)照的3倍左右。另外，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光和蛋白質(zhì)印記技術(shù)我們檢測(cè)了DNA損傷位點(diǎn)的標(biāo)識(shí)分子γH2AX，結(jié)果顯示miR-383減少γH2AX聚集點(diǎn)和聚集程度，抑制γH2AX的蛋白水平，而且由于順鉑藥物(cisplatin)能造成細(xì)胞DNA損傷，經(jīng)順鉑藥物處理后，我們發(fā)現(xiàn)miR-383能夠增強(qiáng)人源睪丸胚胎瘤細(xì)胞(NT-2)對(duì)順鉑藥物的敏感性，說(shuō)明miR-383參與DNA損傷途徑。通過(guò)利用分子信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告

6、基因技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)了蛋白磷酸酶1核內(nèi)靶向亞基(PNUTS)是miR-383的靶基因，而且經(jīng)介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PNUTS參與到miR-383對(duì)γH2AX的調(diào)控途徑。同時(shí)，由于miR-383能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在細(xì)胞周期的G1期，減少?gòu)?fù)制期（S期）細(xì)胞，從而減少γH2AX的表達(dá)。但是通過(guò)，基因沉默PNUTS(siPNUTS)發(fā)現(xiàn)，siPNUTS并不直接影響細(xì)胞周期。綜上所述，miR-383通過(guò)兩條獨(dú)立的通路調(diào)控γH2AX，一方面是通過(guò)靶向PNUTS

7、，從而介導(dǎo)γH2AX的生成;另一方面通過(guò)抑制了細(xì)胞周期的停滯，從而減少γH2AX的表達(dá)。
　　另外一方面，導(dǎo)致男性不育的一個(gè)重要原因是隱睪，隱睪的發(fā)比率為2-4％而且發(fā)病率逐年上漲。在不發(fā)達(dá)國(guó)家中，隱睪的患病率則更為嚴(yán)重。目前臨床上治療隱睪的方法主要是睪丸固定術(shù)，醫(yī)生一般要求在6月-2歲之間進(jìn)行手術(shù)，以減少不育和睪丸癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，即使手術(shù)成功，男嬰在成年后患男性不育的概率達(dá)50％以上，隱睪的發(fā)生機(jī)制和對(duì)睪丸造成的分子通路

8、仍然沒(méi)有明確定論。近年有研究報(bào)道隱睪與下丘腦-垂體-性腺軸激素生成，基因INL3/LGR8的突變等因素有關(guān)，但是隱睪中microRNA的調(diào)控機(jī)制還鮮有報(bào)道。因此本論文也通過(guò)建立隱睪小鼠模型，探索研究了microRNA-210(miR-210)在小鼠隱睪模型中的功能。
　　我們研究發(fā)現(xiàn)在人隱睪患者睪丸組織中，miR-210顯著上升，在小鼠隱睪模型的隱睪側(cè)也有著相同的效應(yīng)。睪丸組織切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，隱睪側(cè)睪丸有明顯的DNA損傷，且