孤核受體NR4A家族的表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系及其在胰島β細(xì)胞中調(diào)控胰島素基因表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、在真核細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是鈣離子儲存、蛋白質(zhì)合成、折疊、加工及質(zhì)量監(jiān)控的重要場所，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生異常變化或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)難以承擔(dān)蛋白折疊的高負(fù)荷時則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERstress），激活細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，細(xì)胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1介導(dǎo)的三條關(guān)鍵的UPR信號通路，調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜對鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)及對蛋白折疊的處理能力，因此UPR通路在細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡中具有舉足輕重的作用。而這一

2、動態(tài)過程的調(diào)控對于維持機(jī)體的正常生理功能至關(guān)重要，在肝臟、脂肪、胰島以及下丘腦等不同的組織器官中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均影響代謝活動。
　　眾所周知，隨著人們生活水平的提高，糖尿?。ㄓ绕涫?型糖尿?。┑陌l(fā)病率呈快速升高的趨勢。2型糖尿病病理發(fā)展的最終結(jié)果是胰島β細(xì)胞的凋亡，目前人們普遍接受的機(jī)制是持續(xù)高糖、游離脂肪酸(FFA)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，ERstress如不能被有效緩解或消除則可啟動β細(xì)胞的凋亡程序。
　　核受體是

3、一類依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子超家族，它具有三個功能結(jié)構(gòu)域:N末端的激活結(jié)構(gòu)域(AF-1)、中間的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和C末端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)。根據(jù)核受體DBD序列的同源性發(fā)現(xiàn)了大量的孤核受體，它們的生理性配體及其功能最初并不清楚。NR4A家族即是這類孤核受體，目前尚未找到其天然的配體。
　　NR4A1（又稱為NUR77、TR3、NGFI-B）、NR4A2(又稱為NURR1、RNR-1、TONOR)、NR4A3(又稱為

4、NOR1、MINOR)三者組成孤核受體NR4A家族。NR4A家族的三個成員在DBD區(qū)約91-95％的序列高度同源，LBD區(qū)約60％序列保守，而激活結(jié)構(gòu)域序列變化較大。NR4A家族是一類早期即刻反應(yīng)基因，細(xì)胞在感受到環(huán)境的生理與物理刺激時，這個家族的基因就會迅速反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)一定的基因表達(dá)從而來應(yīng)對這些刺激。目前關(guān)于NR4A家族與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系研究很少，而且NR4A家族分子與容易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的胰島β細(xì)胞，特別

5、是β細(xì)胞中胰島素的分泌及表達(dá)的關(guān)系也有待去探索。
　　本課題的工作分以下兩部分展開:
　　第一部分在胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞中孤核受體NR4A家族的表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系
　　研究目的:探討在胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞中，細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時孤核受體NR4A家族分子的動態(tài)表達(dá)變化及二者之間的關(guān)系。
　　研究內(nèi)容
　　1、用不同濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG（毒胡蘿卜素）、TM（衣霉素）、PA（棕櫚酸鈉鹽）、DTT（二硫蘇糖醇

6、）刺激小鼠胰島β細(xì)胞MIN6，熒光定量PCR分析UPR標(biāo)志分子Bip、Chop及NR4A家族三個成員（Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3）mRNA表達(dá)變化;逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析UPR標(biāo)志分子剪接型Xbp1（sXbp1）的表達(dá)變化，篩選出既能激活細(xì)胞UPR又能誘導(dǎo)NR4A家族表達(dá)的合適加藥劑量。
　　2、對培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6、小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1完全置換

7、新鮮培養(yǎng)基，熒光定量PCR分析換液后0h，1h，2h，3h，4h，6h，9h，12hNR4A家族分子mRNA表達(dá)變化，westernblotting分析NR4A1蛋白表達(dá)變化，為后續(xù)加藥方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　3、用0.5μMTG分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6，在加藥后0h、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR、

8、熒光定量PCR和westernblotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動態(tài)表達(dá)變化。
　　4、用10μg/mlTM分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6，在加藥后0h、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR、熒光定量PCR和westernblotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動

9、態(tài)表達(dá)變化。
　　5、用0.5mMPA分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6，在加藥后6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR、熒光定量PCR和westernblotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動態(tài)表達(dá)變化。
　　6、用3mMDTT分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hep

10、a1-6，在加藥后0h、30min、1h、2h、3h、4h、6h、9h分別收集細(xì)胞提取RNA，用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動態(tài)表達(dá)變化。
　　7、選用C57BL/6-ob/ob雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，同周齡的C57BL/6小鼠為對照組，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，每周稱量動物體重一次，建立小鼠肥胖癥動物模型。造模成功后，處死動物，取胰腺、肝臟組織進(jìn)行RNA提取，熒光定量PCR分析肥胖體征動物中UPR

11、標(biāo)志分子及NR4A家族分子的表達(dá)變化。
　　8、用0.5μMTG刺激MIN6細(xì)胞0h、3h、6h，通過細(xì)胞核質(zhì)分離試劑盒抽提核蛋白和胞漿蛋白，以westernblotting技術(shù)分析NR4A1在細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況。
　　9、用0.SμMTG刺激HepG2細(xì)胞2h，0.5mMPA刺激HepG2細(xì)胞10h，對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)NR4A1的表達(dá)及分布情況。
　　研究結(jié)果：
　　1、MIN6細(xì)

12、胞中，0.1-1μMTG處理2h、10μg/mlTM處理3h、2-4mMDTT刺激2h、0.4-0.8mMPA刺激12h能極顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)(P＜0.01)，導(dǎo)致NR4A家族分子mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選出各誘導(dǎo)劑的合適劑量，即0.5μMTG、10μg/mlTM、3mMDTT、0.5mMPA。
　　2、MIN6、HepG2、Hepa1-6、3T3-L1四種細(xì)胞在完

13、全置換培養(yǎng)基后4h內(nèi)，NR4A家族三個分子mRNA水平均明顯升高;MIN6細(xì)胞中NR4A1蛋白水平在換液后1-6h顯著高于基礎(chǔ)水平，2h達(dá)到峰值;換液6h后NR4A家族三個分子mRNA和蛋白水平逐漸下降恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，這說明換液短時間內(nèi)NR4A家族處于高表達(dá)水平，因此需要改變后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的加藥方式，即在加藥處理前12h給細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基，加藥時吸取一定體積的誘導(dǎo)劑貯存液(1mMTG、5mg/mlTM、1MDTT)直接加入培養(yǎng)基中;而0.5

14、mMPA仍采取完全置換含藥培養(yǎng)基的處理方式。
　　3、用0.5μMTG處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6三種細(xì)胞，均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，同時誘導(dǎo)孤核受體NR4A家族所有分子的表達(dá)，其中以NR4A1和NR4A2表達(dá)升高程度更為顯著。
　　4、用10μg/mlTM處理MIN6、HepG2、Hepa1-6三種細(xì)胞，同TG處理一樣，均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)

15、生典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，NR4A分子被誘導(dǎo)表達(dá)，但NR4A家族mRNA在TM處理后的表達(dá)增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TG處理，最高增加倍數(shù)僅為TG處理增加倍數(shù)的40％，且TM處理時以NR4A2分子應(yīng)答為主。
　　5、用0.5mMPA處理MIN6、HepG2、Hepa1-6三種細(xì)胞，雖然能激活UPR相關(guān)信號通路的分子表達(dá)，但各基因表達(dá)增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TG處理;同時PA誘導(dǎo)表達(dá)的NR4A家族mRNA增加幅度也相應(yīng)的低

16、于TG處理。在不同的細(xì)胞中對PA處理發(fā)生應(yīng)答的NR4A成員也不同。
　　6、用3mMDTT處理MIN6細(xì)胞、HepG2細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NR4A家族誘導(dǎo)表達(dá)升高的方式和程度同0.5μMTG處理這兩種細(xì)胞相似。但3mMDTT對小鼠Hepa1-6細(xì)胞的刺激結(jié)果同10μg/mlTM、0.5mMPA處理Hepa1-6細(xì)胞類似。
　　7、10周齡ob/ob小鼠體重是對照小鼠體重的1.7倍，ob/ob小鼠呈明顯的肥胖癥體征，熒光定量P

17、CR分析表明肥胖小鼠胰腺和肝臟中UPR分子Bip、Chop表達(dá)明顯升高，孤核受體NR4A家族成員的mRNA水平也顯著高于對照小鼠。
　　8、用0.5μMTG處理MIN6細(xì)胞3h、6h，用westernblotting法分析細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白中NR4A1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TG處理誘導(dǎo)表達(dá)升高的NR4A1蛋白主要集中分布于細(xì)胞核中;用0.5μMTG處理HepG2細(xì)胞2h、0.5mMPA處理HepG2細(xì)胞10h，對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，熒光

18、顯微鏡觀察結(jié)果表示TG或PA誘導(dǎo)表達(dá)升高的NR4A1蛋白主要集中分布于細(xì)胞核內(nèi)。
　　研究結(jié)論
　　本部分實(shí)驗(yàn)可得出以下結(jié)論:
　　1、由于NR4A家族是早期即刻反應(yīng)基因，完全置換培養(yǎng)基就能誘導(dǎo)其表達(dá)，因此時間動態(tài)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意加藥方式，即細(xì)胞換液12h后，吸取一定體積的TG、TM、DTT誘導(dǎo)劑貯存液直接加入培養(yǎng)基中;而PA需要長時間刺激才能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因此仍采取完全置換含藥培養(yǎng)基的方式加藥處理。
　　

19、2、用0.5μMTG、10μg/mlTM、0.5mMPA、3mMDTT，四種ERstress誘導(dǎo)劑處理胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞，在一定時間內(nèi)均能激活細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng)，同時細(xì)胞中孤核受體NR4A家族表達(dá)升高，雖然不同試劑的處理引起NR4A家族表達(dá)升高的幅度不同，但均說明細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時也引起NR4A家族的表達(dá)升高。
　　3、在肥胖動物特別是基因缺陷造成的ob/ob肥胖癥小鼠中，肝臟、胰腺等組織中有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，同時NR4A

20、家族分子的表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激呈一定的正相關(guān)。
　　4、在細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，表達(dá)升高的NR4A分子集中分布于細(xì)胞核中，這可能與NR4A分子作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分孤核受體NR4A家族對胰島β細(xì)胞中胰島素基因表達(dá)的調(diào)控
　　研究目的:探討孤核受體NR4A家族在胰島β細(xì)胞中對胰島素基因表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制。
　　研究內(nèi)容：
　　1、通過AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建包裝純化過表達(dá)NR4A1、NR4

21、A3分子的兩種重組腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3)，選擇只表達(dá)GFP的載體腺病毒為對照病毒(Ad-GFP)，通過紫外分光光度法和梯度稀釋感染法檢測病毒效價(jià)。
　　2、用0.5μMTG、0.5mMPA刺激小鼠胰島β細(xì)胞MIN6，以及用重組腺病毒感染MIN6細(xì)胞后，通過碘([125]I)放射免疫法測定葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。
　　3、把Ad-NR4A1-HA，Ad-NR4A3兩種重組腺病毒分別梯度稀

22、釋，用對照病毒Ad-GFP按相當(dāng)效價(jià)劑量補(bǔ)充以保證每組病毒顆粒數(shù)一致，感染兩種胰島β細(xì)胞(MIN6、INS1)，44h后通過放射免疫法測定葡萄糖刺激的胰島素分泌水平;用同樣方法稀釋的腺病毒Ad-NR4A3感染MIN6細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞提取RNA，RT-PCR分析腺病毒感染后胰島素基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　4、相當(dāng)效價(jià)的三種腺病毒(0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0.5μl/mlAd-NR4A3、0.25μl/m

23、lAd-GFP)感染接種于飛片上的MIN6細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光染色分析過表達(dá)NR4A1、NR4A3蛋白在MIN6細(xì)胞中的定位分布情況。
　　5、用過表達(dá)NR4A1的慢病毒感染MIN6細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)NR4A1的細(xì)胞株，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白分離抽提，westernblotting檢測NR4A1在MIN6細(xì)胞中的定位分布情況。
　　6、通過基因工程的方法構(gòu)建hNR4A3cDNA野生型及各結(jié)構(gòu)域缺失突變

24、體過表達(dá)重組質(zhì)粒(全長野生型、△AF112-288aa，△DBD292-364aa，△LBD398-626aa)，lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各種質(zhì)粒進(jìn)入MIN6細(xì)胞中，通過稻瘟菌素篩選穩(wěn)定表達(dá)各種突變體的MIN6細(xì)胞株，westernblotting檢測各蛋白過表達(dá)水平，RT-PCR分析各種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中胰島素基因Ins1、Ins2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
　　7、相當(dāng)效價(jià)的三種腺病毒(0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0

25、.5μl/mlAd-NR4A3、0.25μl/mlAd-GFP)感染兩種胰島β細(xì)胞(MIN6、INS1)，RT-PCR和熒光定量PCR分析胰島素基因及調(diào)控胰島素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(NeuroD1、Pdx1、MafA、Glis3)mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建包裝純化了三種腺病毒，效價(jià)相當(dāng)?shù)娜N病毒的使用劑量為0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0.5μl/mlAd-NR4A3、0.25μl/mlAd

26、-GFP，感染MIN6細(xì)胞后均能達(dá)到80％以上的感染率。
　　2、用0.5μMTG、0.5mMPA處理MIN6細(xì)胞顯著降低了細(xì)胞分泌胰島素的能力;用Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3腺病毒感染MIN6細(xì)胞也顯著減少了細(xì)胞分泌到上清中的胰島素含量(p＜0.01)，初步說明NR4A1/3過表達(dá)抑制了MIN6細(xì)胞的胰島素分泌功能。
　　3、梯度稀釋后的腺病毒感染兩種胰島β細(xì)胞，GSIS結(jié)果表明隨著NR4A1/3蛋白的表達(dá)增加

27、，細(xì)胞分泌的胰島素下降，即NR4A1/3的表達(dá)量與細(xì)胞分泌的胰島素呈負(fù)相關(guān);RT-PCR結(jié)果同樣說明胰島素基因mRNA表達(dá)水平與NR4A3蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，即NR4A3蛋白表達(dá)越多，Ins1和Ins2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)越少，說明孤核受體NR4A家族分子具有下調(diào)胰島β細(xì)胞中胰島素基因表達(dá)的功能。
　　4、不管在重組NR4A1/3腺病毒感染的MIN6細(xì)胞中，還是篩選出的穩(wěn)定過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞株中，過表達(dá)的NR4A分子均集中分布在

28、細(xì)胞核中。
　　5、篩選得到NR4A3野生型和各結(jié)構(gòu)域缺失突變體的穩(wěn)定過表達(dá)MIN6細(xì)胞株;野生型(N)和LBD缺失突變型(△L)細(xì)胞株中胰島素基因（Ins1、Ins2）的轉(zhuǎn)錄明顯低于對照細(xì)胞;而AF1區(qū)缺失型(△A)和DBD區(qū)缺失型(△D)細(xì)胞株中胰島素基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與對照細(xì)胞無明顯的區(qū)別，說明NR4A3分子中的AF1區(qū)和DBD區(qū)對下調(diào)胰島素基因轉(zhuǎn)錄是必需的。
　　6、兩種重組腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-N

29、R4A3)感染兩種胰島β細(xì)胞(MIN6、INS1)，熒光定量PCR分析說明NR4A腺病毒感染的細(xì)胞中胰島素基因、胰島素調(diào)控因子基因mRNA水平均顯著低于對照病毒感染的細(xì)胞，說明NR4A家族可以通過抑制胰島素相關(guān)調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄間接的下調(diào)胰島素基因的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了過表達(dá)NR4A家族分子的重組腺病毒及各種穩(wěn)轉(zhuǎn)MIN6細(xì)胞株。
　　2、在MIN6細(xì)胞中過表達(dá)的NR4A家族蛋白集中分布在細(xì)胞核中，起轉(zhuǎn)