SIRT1基因與脂肪細胞胰島素受體的關(guān)系.pdf

1、背景與目的：
　　隨著經(jīng)濟與社會發(fā)展,人類飲食生活習慣的變化,肥胖及2型糖尿病的發(fā)病率在逐年升高,因此關(guān)于糖尿病及肥胖癥的研究現(xiàn)已成為生物學及醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點問題。目前對糖尿病的發(fā)病機制的認識已經(jīng)不單純停留在體內(nèi)胰島素缺乏的水平上,越來越多的研究證明,肥胖及其他因素造成的胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)病中起著越來越重要的作用。
　　胰島素是哺乳動物體內(nèi)促進葡萄糖進入細胞內(nèi)的唯一激素,胰島素缺乏或者因抵抗導致的胰島素不敏感在糖尿病發(fā)

2、生中起重要作用?，F(xiàn)已知胰島素在體內(nèi)要通過以下步驟發(fā)揮作用:胰島素到達相應(yīng)的靶細胞以后,與靶細胞膜表面的胰島素受體(insulin receptor, INSR)的α亞基結(jié)合,激活β亞基,導致受體自動磷酸化,從而引起胰島素受體底物(Insulin receptor substrate,IRS)的酪氨酸磷酸化,磷酸化的 IRS-1可激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K),引起 PI3K的

3、活性升高,最終促進糖的轉(zhuǎn)運活動以及胰島素的其他功能。
　　在八十年代發(fā)現(xiàn)的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)是一個重要的調(diào)節(jié)基因,可以延長相當多物種的壽命,它是與基因沉默及rDNA重組維持基因穩(wěn)定性相關(guān)的重要基因,具有組蛋白去乙酰化活性。在哺乳動物中Sir2有7個同源基因,分別命名為 SIRT1-SIRT7,它們在細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復、抑制細胞凋亡及延長細胞壽命等方面

4、都發(fā)揮著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn) SIRT1在脂代謝、糖代謝、心血管疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。
　　現(xiàn)已知 SIRT1可作用于胰島素/胰島素樣生長因子-1(Insulin/IGF-1)信號通路中的FOXO、IRS-1、PI3K/Akt及脂肪特異性基因PPARγ等,從而改善胰島素信號傳導,參與糖脂代謝調(diào)控。那么SIRT1是否可以作用于 Insulin/IGF-1信號通路最上游基因——胰島素受體基因呢?是否可以調(diào)節(jié)胰島素受體蛋白

5、的數(shù)目及親和力,從而控制整個糖代謝通路呢?我們推斷,在SIRT1與脂肪細胞胰島素受體之間應(yīng)該存在著某種聯(lián)系,SIRT1很可能通過作用于脂肪細胞胰島素通路Insulin/IGF-1最上游胰島素受體基因,調(diào)節(jié)脂肪細胞表面胰島素受體蛋白的表達,從而參與糖代謝的調(diào)控。
　　本實驗將通過腺病毒轉(zhuǎn)染誘導分化后的3T3-L1細胞來研究SIRT1基因?qū)χ炯毎葝u素受體基因及蛋白表達的影響,從分子水平上研究糖尿病發(fā)生發(fā)展的機制,為進一步探索胰島素

6、抵抗的機制及治療作了鋪墊。
　　材料與方法：
　　采用國際公認的前脂肪細胞系3T3-L1為研究對象,在一定條件下將其誘導分化為成熟的脂肪細胞,油紅O染色鑒定。用Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細胞,使其SIRT1基因高表達,檢測INSR基因及蛋白表達情況。實驗分2組:(1)陰性對照組(2) Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒轉(zhuǎn)染組。收集兩組細胞,分別提取總RNA,定量PCR檢測INSR基因和SI

7、RT1基因的表達情況。并用免疫熒光細胞化學染色、Western blot檢測兩組細胞中胰島素受體及SIRT1蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光細胞化學染色結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組SIRT1蛋白及INSR蛋白表達均較對照組增加。
　　2、 Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組SIRT1蛋白及INSR蛋白表達均較對照組增加。
　　3、 Q-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組SIR

8、T1基因有明顯上調(diào);INSR明顯下調(diào)(可能由于Q-PCR實驗結(jié)果不準確)。
　　結(jié)論：
　　上調(diào)由前脂肪細胞系3T3-L1分化成熟的脂肪細胞的SIRT1基因表達可影響其INSR的基因及蛋白表達。本實驗顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組INSR基因mRNA水平下降,但蛋白水平升高。此處mRNA與蛋白表達水平不一致,可能因?qū)嶒灢僮饔姓`導致Q-PCR結(jié)果不精確有關(guān);而WB結(jié)果通常較為可靠,且WB能顯示最終蛋白表達情況,也與本實驗中免疫熒光