多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7的基因表達(dá)及甲基化調(diào)控.pdf

1、目的：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）許多疾病中被認(rèn)為一種抑癌基因，本研究意義在于探索胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）在體外實(shí)驗(yàn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266中表達(dá)，并探測U266中IGFBP7啟動(dòng)子甲基化程度，進(jìn)一步通過甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-aza-dc）干預(yù)并檢測對瘤細(xì)胞增殖影響。
　　方法：體外培養(yǎng)U266細(xì)胞株,并以正常對照骨髓單個(gè)核細(xì)胞（N-BMMNC）作為對照，分別提取RNA，采

2、用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測IGFBP7mRNA水平的表達(dá)，提取細(xì)胞DNA重亞硫酸氫鈉甲基化修飾，采用甲基化特異性 PCR（MSP）實(shí)驗(yàn)方法研究其 CpG島的甲基化水平，不同階梯濃度的5-aza-dc（5、10和20μmol/L）干預(yù)U266細(xì)胞株，在48h收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí) RT-PCR法和蛋白印跡法檢測不同濃度各組IGFBP7mRNA及各組蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測分析藥物干預(yù)前后各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及周期。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)

3、軟件對各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均用-x±SD表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組對照使用統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：U266細(xì)胞株IGFBP7 mRNA較N-BMMNC呈下調(diào)表達(dá)，MSP檢測U266 IGFBP7的啟動(dòng)子CpG島存在明顯甲基化，不同階梯濃度的5-aza-dc干預(yù)U266細(xì)胞株48 h，觀察到IGFBP7 mRNA呈劑量依賴型表達(dá)增高（r=0.952, P＜0.05），I

4、GFBP7蛋白表達(dá)呈劑量依賴型增高（r=0.983, P＜0.05），藥物濃度階梯增加使得U266在G0/G1期細(xì)胞隨濃度依賴增多（r=0.966, P＜0.05），細(xì)胞凋亡率亦隨濃度依賴增加（r=0.958, P＜0.05）。
　　結(jié)論：U266細(xì)胞中IGFBP7 mRNA較N-BMMNC表達(dá)下調(diào)，該種表達(dá)下調(diào)或失活機(jī)制與IGFBP7啟動(dòng)子的CpG島的異常高甲基化有關(guān)，5-aza-dc干預(yù)使得U266細(xì)胞中IGFBP7mRNA及