增齡對(duì)小鼠肺纖維化模型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Snail影響的研究.pdf

1、目的：
　　研究不同年齡段（青年、老年）小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)指標(biāo)：上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-Cadherin, E-Cad)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle Actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及轉(zhuǎn)錄因子Snail隨病程進(jìn)展的表達(dá)變化，初步探討增齡對(duì)小鼠肺纖維化病

2、變程度及EMT的影響，為進(jìn)一步探索增齡促進(jìn)肺纖維化進(jìn)展的可能機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：
　　20周齡雄性C57/BL6小鼠60只，隨機(jī)分為兩組：青年組（20周齡）、老年組（飼養(yǎng)至26周齡）。上述兩組每組再隨機(jī)分為5組，其中1組作為生理鹽水對(duì)照組(NS)，給予氣管內(nèi)注入0.9％氯化鈉注射液，于第28d處死；其余4組為肺纖維化模型組，按5mg/kg劑量，予氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素(bleomycin,BLM)，分別于造模后第7d、14

3、d、21d及28d處死，取左肺制備石蠟切片，右肺液氮凍存后行相關(guān)蛋白R(shí)T-PCR檢測(cè)。石蠟切片行HE染色及Masson染色，通過肺組織形態(tài)改變從而判斷肺纖維化病變進(jìn)展程度；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo) E-Cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表達(dá)水平，平均光灰度值使用美國(guó)Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)測(cè)量，反映病程中EMT的動(dòng)態(tài)變化；RT-PCR法檢測(cè)液氮凍存肺組織轉(zhuǎn)錄因子S

4、nail1、Snail2及其調(diào)控蛋白E-cad的mRNA的表達(dá)水平。使用SPSS19.0對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采取“均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　HE染色及Masson染色結(jié)果示BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型組，隨病程進(jìn)展，肺實(shí)質(zhì)破壞、膠原生成量較對(duì)照組增加明顯，表明造模成功。將老年與青年小鼠同時(shí)間點(diǎn)的纖維化病變程度進(jìn)行對(duì)比，前者更嚴(yán)重。免疫組化法結(jié)果顯示，E-Cadherin

5、主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞。青年、老年兩組小鼠對(duì)照組表達(dá)較多，各時(shí)間點(diǎn)模型組的表達(dá)較對(duì)照組減少，且隨病程進(jìn)展，減少更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步將兩組模型小鼠的各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量進(jìn)行比較，老年較青年組表達(dá)較少（P<0.05），而兩組對(duì)照組無(wú)明顯差異。Vimentin主要表達(dá)于支氣管黏膜上皮及肺間質(zhì)細(xì)胞，α-SMA在對(duì)照組只表達(dá)于支氣管及血管平滑肌細(xì)胞，而在模型組肺間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞中還可觀測(cè)到其表達(dá)。

6、上述兩個(gè)指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)模型組表達(dá)較對(duì)照組增加，隨病程進(jìn)展，增多更顯著（P<0.05）；同時(shí)間點(diǎn)老年模型組較青年模型組表達(dá)較多（P<0.05），兩組對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　RT-PCR法結(jié)果示在青年、老年兩組小鼠中，隨時(shí)間推移，Snail1及Snail2的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)（相較對(duì)照組，模型組14d表達(dá)量明顯增加，28d較14d表達(dá)明顯減少，P<0.05）。對(duì)比兩組小鼠同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，老年模型組較青年模型組于14d增加

7、更為明顯，28d減少更為緩慢（P<0.05），兩組對(duì)照組無(wú)明顯差異。E-Cadherin模型組14d、28d的表達(dá)較對(duì)照組減少，且隨病程進(jìn)展，減少更為明顯（P<0.05）。相較青年模型組，同時(shí)間點(diǎn)老年模型組表達(dá)較少（P<0.05），兩組對(duì)照組無(wú)明顯差異，與免疫組化結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論：
　　BLM氣管內(nèi)注入誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型成功，同時(shí)期老年模型組相較青年模型組肺纖維化及EMT程度更嚴(yán)重，而對(duì)照組無(wú)明顯差異。老年模型組S