扣囊復(fù)膜酵母A11菌株酸性蛋白酶基因和MIG1基因敲除對酶的生產(chǎn)和海藻糖積累的影響.pdf

1、扣囊復(fù)膜酵母菌(Saccharomyeopsis fibuligera)是子囊菌屬的一個(gè)種,它可以利用淀粉積累海藻糖,并能分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡糖苷酶和其它酶。所以扣囊復(fù)膜酵母在發(fā)酵行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和生物能源工業(yè)有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值,但是人們對它的生理遺傳系統(tǒng)了解得還很少。
　　 本實(shí)驗(yàn)室最近幾年對高產(chǎn)海藻糖的扣囊復(fù)膜酵母A11菌株進(jìn)行了大量研究,獲得許多重要結(jié)果。由于酸性蛋白酶在酸性條件下可以分解其它酶,對其它酶

2、的產(chǎn)生會(huì)造成不利的影響。所以本研究試圖通過基因敲除法敲掉扣囊復(fù)膜酵母A11菌株酸性蛋白酶基因,然后研究該基因的敲除對其它酶的產(chǎn)生和穩(wěn)定會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響。首先利用編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因HPT(hygomycm Bphosphotransferase)的ORF(Open Reading Frame)替換A11菌株的酸性蛋白酶基因的ORF。獲得的敲除菌株A11-a能在含有潮霉素的培養(yǎng)基中生長,并且在牛奶平板上不能形成水解透明圈,而原始

3、菌株A11在牛奶平板上能形成大而清晰的水解透明圈。在培養(yǎng)3 d的情況下,敲除菌株A11-a的酸性蛋白酶和淀粉酶的活性分別為0.89 U/mL和424.7 U/mL,而原始菌株A11分別為13.5 U/mL和259.9U/mL,說明了酸性蛋白酶的缺失會(huì)大大提高敲除菌株淀粉酶的合成能力。敲除菌株A11-a原始菌株A11產(chǎn)生的粗淀粉酶放置在37℃下2 d,它們殘余的活性分別為原來的88.8％和45.5％,說明了酸性蛋白酶的缺失會(huì)大大提高敲除菌

4、株淀粉酶的穩(wěn)定性。敲除菌株A11-a細(xì)胞的海藻糖積累量達(dá)到了細(xì)胞干重的28.3％(w/w),而原始菌株A11只有23.6(w/w),說明了酸性蛋白酶的缺失還會(huì)大大提高敲除菌株轉(zhuǎn)化淀粉合成海藻糖的能力。
　　 目前如何有效地從酵母細(xì)胞中提取海藻糖是一個(gè)問題,一般是用0.5M三氯乙酸提取,但是三氯乙酸是蛋白質(zhì)變性劑,并且具有很強(qiáng)的腐蝕作用。有研究表明當(dāng)高熱敏滲透突變株(highly thermosensitive and perme

5、able mutant)酵母細(xì)胞在37℃的低滲透壓水中孵育時(shí),細(xì)胞內(nèi)含物能被釋放出來。所以本研究利用上述獲得的高含海藻糖扣囊復(fù)膜酵母A11-a菌株經(jīng)亞硝基胍誘變獲得了這樣的高熱敏滲透突變菌株A11-b,在37℃的蒸餾水中過夜處理能釋放自身海藻糖含量的73.8％,而扣囊復(fù)膜酵母菌A11-a菌株在同樣條件下僅能釋放10％的海藻糖。突變菌株A11-b細(xì)胞懸浮在蒸餾水中經(jīng)37℃過夜處理后,細(xì)胞體積比經(jīng)過相同條件處理的A11-a菌株要大,說明由于

6、細(xì)胞通透性發(fā)生變化,導(dǎo)致細(xì)胞在蒸餾水中發(fā)生膨脹。在搖瓶和5-1發(fā)酵罐中培養(yǎng),突變菌株A11-b的生長量和海藻糖積累量與菌株A11-a幾乎相同。突變菌株A11-b和菌株A11-a都能利用木薯淀粉在細(xì)胞中累積大約28.0％(w/w)的海藻糖。用蒸餾水從突變株A11-b中提取和純化了海藻糖,最后獲得了高純度的海藻糖晶體。從而建立了一種從酵母菌細(xì)胞中提取海藻糖的簡單、經(jīng)濟(jì)、安全和有效的新工藝。
　　 在微生物中葡萄糖阻遏是一種非常普遍的

7、現(xiàn)象,在葡萄糖存在情況,許多酶的合成和基因表達(dá)都會(huì)受到抑制。參與葡萄糖阻遏作用的主要兩種蛋白是Snf1和Mig1,Snf1是一種蛋白激酶,在培養(yǎng)基中有葡萄糖存在情況下可以使Mig1發(fā)生磷酸化反應(yīng),磷酸化的Mig1可以使有關(guān)的基因表達(dá)受到阻遏,所以如果把編碼Mig1的基因敲除,酵母細(xì)胞不管是否生長在葡萄糖培養(yǎng)基中有關(guān)基因表達(dá)都不會(huì)受到阻遏。本研究首先用簡并引物PCR祛和反向PCR法從扣囊復(fù)膜酵母A11菌株的基因組DNA中克隆出了MIG1(

8、Multieopy Inhibitor of Glucose)基因?？寺〉腗IG1基因(NCBI的登錄號:HM450676)全長1152 bp,編碼384個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其它真菌的Migls非常類似,有高度保守的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),Mig1蛋白還有一個(gè)短的保守模序,可能在葡萄糖阻遏中有重要作用。然后敲除扣囊復(fù)膜酵母A11菌株的MIGl基因,利用上述的HPT基因ORF替換了MIG1基因的ORF,結(jié)果在含有潮霉素的YPD平

9、板上獲得了敲除菌株A11-c,它能在含有2-脫氧-D葡萄糖的YPS平板上生長,而原始菌株A11則都不能,說明敲除菌株的葡萄糖阻遏得到了解除。與菌株A11相比,敲除菌株A11-c淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶的產(chǎn)量有很大提高,同時(shí)編碼α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶基因的表達(dá)量也有極大提高。這就證明,扣囊復(fù)膜酵母中的Mig1確實(shí)能阻遏某些基因的轉(zhuǎn)錄,它對一些基因的表達(dá)和一些胞外酶的生產(chǎn)起調(diào)控作用。
　　 綜上所述