蛋白酶Tmprss11f基因敲除小鼠的制備及表型分析.pdf

1、目的：II型跨膜絲氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶超家族中的一個(gè)亞家族。在結(jié)構(gòu)上，所有的TTSPs都包含一個(gè)近氨基端的跨膜區(qū)以及一個(gè)羧基端的蛋白酶區(qū)。TTSPs通過跨膜區(qū)錨定在細(xì)胞膜上，而蛋白酶區(qū)是TTSPs在細(xì)胞膜表面催化蛋白水解的功能活性區(qū)域。TTSP家族的成員包括腸激酶、corin、matriptases以及 hepsin等，它們參與了許

2、多生理病理過程，比如食物消化、血壓調(diào)節(jié)、鐵代謝、耳蝸發(fā)育等。TTSPs的表達(dá)缺失或缺陷會(huì)引起營養(yǎng)不良、高血壓、缺鐵性貧血以及先天性耳聾等疾病。人類的TTSPs有19個(gè)成員，分為4個(gè)亞組，包括hepsin/TMPRSS組、matriptase組、HAT/DESC組以及corin組。蛋白酶TMPRSS11f（又名HAT-Like4，HATL4）是HAT/DESC亞組中的一個(gè)成員。我們實(shí)驗(yàn)室最新研究發(fā)現(xiàn)，TMPRSS11f在正常人的血細(xì)胞以及

3、骨髓細(xì)胞中不表達(dá)，而在急性髓細(xì)胞性白血?。ˋcute Myeloid Leukemia，AML）細(xì)胞中異常高表達(dá)；并且TMPRSS11f的異常表達(dá)與AML病人的不良臨床預(yù)后有關(guān)。這提示TMPRSS11f可能參與了 AML的病理過程。然而，迄今還沒有研究報(bào)道TMPRSS11f的正常生物學(xué)功能。本研究旨在檢測 TMPRSS11f在人及小鼠組織中的表達(dá)情況，然后利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Tmprss11f基因敲除小鼠，并對其表型進(jìn)行

4、分析。通過對Tmprss11f基因敲除小鼠的生存能力、生育能力、發(fā)育狀況和血液指標(biāo)等進(jìn)行檢測分析，以了解TMPRSS11f在胚胎發(fā)育、生長和生存、以及血細(xì)胞成熟過程中的生物學(xué)作用。
　　方法：⑴利用免疫組化技術(shù)檢測TMPRSS11f蛋白在人組織中的表達(dá)定位。⑵利用RT-PCR技術(shù)檢測Tmprss11f mRNA在小鼠組織中的表達(dá)分布。⑶利用免疫組化技術(shù)檢測Tmprss11f蛋白在小鼠組織中的表達(dá)定位。⑷利用CRISPR/Cas9技

5、術(shù)建立Tmprss11f基因敲除小鼠。⑸利用RT-PCR技術(shù)從mRNA水平驗(yàn)證TMPRSS11f基因敲除。⑹分析雜合子間交配得到的新生和斷乳后小鼠基因型比例。⑺檢測Tmprss11f基因敲除小鼠體重增長及長期生存狀況。⑻檢測Tmprss11f基因敲除小鼠交配后每胎仔數(shù)。⑼檢測Tmprss11f基因敲除小鼠血細(xì)胞以及血生化指標(biāo)。⑽利用蘇木素伊紅染色觀察Tmprss11f基因敲除小鼠組織形態(tài)。⑾通過傷口愈合以及游泳實(shí)驗(yàn)，分析Tmprss11

6、f基因敲除對小鼠傷口愈合、皮膚保濕以及體溫調(diào)節(jié)能力的影響。
　　結(jié)果：①TMPRSS11f表達(dá)于人類及小鼠的氣管、食管、皮膚等組織。②TMPRSS11f定位于人類及小鼠表皮組織中的皮脂腺以及氣管的粘膜層等。③表型分析顯示，與野生型小鼠相比，Tmprss11f基因敲除小鼠的生長發(fā)育、生育能力以及組織形態(tài)沒有明顯的區(qū)別。④血常規(guī)、血生化實(shí)驗(yàn)顯示，野生型和Tmprss11f基因敲除小鼠的各指標(biāo)沒有明顯差異。⑤Tmprss11f基因敲除小

7、鼠傷口愈合、皮膚保濕及體溫調(diào)節(jié)的能力未見明顯異常。
　　結(jié)論：TMPRSS11f廣泛表達(dá)于人類及小鼠的上皮組織中，包括皮膚的皮脂腺、氣管的纖毛以及腺體等。通過對構(gòu)建的Tmprss11f基因敲除小鼠的表型分析，發(fā)現(xiàn)在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，Tmprss11f基因的缺失對小鼠胚胎發(fā)育、生長成熟、生育能力、長期生存、血細(xì)胞生成以及皮膚的功能沒有明顯的影響。Tmprss11f基因敲除小鼠的表型可能需要在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)刺激條件下才能顯示出來。我們構(gòu)