胃癌細胞SGC-7901中β3Gn-T8與轉錄因子c-Jun相關性初探.pdf

1、目的:β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(β3GnTs)家族是糖基轉移酶的重要成員。其中β1，3葡萄糖基轉移酶8(β3Gn-T8)，又名β1，3半乳糖基轉移酶7(β3GalT7)，是本課題組首先在國際上克隆獲得的人類糖基轉移酶新基因。本論文通過生物信息學方法分析了β3Gn-T8上游調控序列啟動子區(qū)，發(fā)現β3Gn-T8啟動子區(qū)有多個c-Jun結合位點。為了進一步闡明β3GnT8與c-jun的相關性，本研究以c-jun中等表達和β3Gn-T

2、8高表達的人胃癌SGC-7901細胞株為研究對象，探討胃癌SGC-7901細胞株中轉錄因子c-Jun對糖基轉移酶β3Gn-T8的轉錄調控。
　　 方法:
　　 1、應用三種生物信息學軟件對β3Gn-T8啟動子區(qū)的轉錄因子c-Jun的結合位點進行預測，并構建c-Jun基因的正義表達載體，經酶切、測序鑒定重組質粒。
　　 2、根據預測結果構建β3Gn-T8啟動子區(qū)系列截短體，應用雙熒光素酶報告基因技術分析β3Gn-T

3、8啟動子區(qū)系列截短體的轉錄激活活性。
　　 3、設計并構建4條針對c-Jun mRNA靶點的siRNA真核表達質粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同時設計shRNA無關序列作為陰性對照(negativecontrol，NC)，并構建表達載體;以脂質體法轉染胃癌SGC-7901細胞，熒光顯微鏡觀察以最高轉染效率和最低細胞死亡率為原則，優(yōu)化轉染條件，根據優(yōu)化的條件將pGPU6/GFP/Neo-shRNA質粒轉染胃癌SGC

4、-7901細胞，應用RT-PCR和Western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測四組pGPU6/GFP/Neo-shRNA對c-Jun基因表達的抑制作用，篩選出干擾效果最好的一組表達載體用于后續(xù)實驗。
　　 結果:
　　 1、生物信息學分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三種在線軟件預測結果分析β3Gn-T8啟動子區(qū)存在著c-Jun基因的多個結合位點。
　　 2、雙熒光素酶報告基因結果顯示

5、:c-Jun對β3Gn-T8啟動子區(qū)具有轉錄激活作用，其中啟動子區(qū)—561/+8片段的轉錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性。
　　 3.pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質粒表達載體構建:靶向c-Jun mRNA的四個pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質粒表達載體經酶切、測序鑒定，證實載體構建成功;重組質粒表達載體通過脂質體介導轉染人胃癌SGC-7901細胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，RT-PCR和Wes

6、tern blot結果證實pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對c-Jun表達抑制的效果最好。
　　 結論:
　　 1、生物信息學軟件預測結果顯示β3Gn-T8啟動子區(qū)存在著轉錄因子c-Jun的多個結合位點。
　　 2、雙熒光素酶報告基因結果顯示c-Jun對β3Gn-T8啟動子區(qū)具有轉錄激活作用，啟動子區(qū)—561/+8片段的轉錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性。
　　 3.針對c-Jun基