結(jié)腸癌中β3GnT8與轉(zhuǎn)錄因子c-jun的相關(guān)性探討及其在侵襲遷移進(jìn)程中的功能研究.pdf

1、目的：
　　探究轉(zhuǎn)錄因子c-jun對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及研究β3GnT8與c-jun在結(jié)腸癌侵襲遷移中的分子機(jī)制。
　　方法：
　　（1）培養(yǎng)三種人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、LoVo，并通過Western-blot檢測(cè)這三種結(jié)腸癌細(xì)胞中c-jun和β3GnT8蛋白的表達(dá)水平及通過Transwell法檢測(cè)c-jun和β3GnT8高、低表達(dá)的細(xì)胞在24h時(shí)的侵襲遷移能力；
　?。?）ChI

2、P技術(shù)檢測(cè)c-jun與β3GnT8基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用；
　?。?）將c-jun過表達(dá)質(zhì)粒、c-jun shRNA干擾載體及其空載體通過lip2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染至c-jun和β3GnT8蛋白的表達(dá)低的SW480細(xì)胞和表達(dá)程度高的LoVo細(xì)胞中；
　　（4）熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染帶有GFP標(biāo)記載體的細(xì)胞株，Real time-PCR及Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SW480中c-jun上調(diào)后和LoVo細(xì)胞中c-

3、jun下調(diào)后β3GnT8、CD147以及相關(guān)分子的mRNA和蛋白的表達(dá)變化；
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-jun對(duì)β3GnT8參與合成的細(xì)胞表面多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)水平；
　　（6）Transwell和細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480中c-jun上調(diào)后和 LoVo中 c-jun下調(diào)后，對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響；
　　（7）篩選獲得β3GnT8和β3GnT2基因的有效siRNA片段；
　?。?）將c-jun過表達(dá)載

4、體與篩選獲得的β3GnT8、β3GnT2基因的最有效干擾片段通過脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)β3GnT8mRNA的表達(dá)變化，并通過Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：
　?。?）Western-blot檢測(cè)三株結(jié)腸癌細(xì)胞株中c-jun和β3GnT8的蛋白表達(dá)水平由低到高依次為SW480→SW620→LoVo，Transwell結(jié)果顯示24h時(shí)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)極少，而LoVo

5、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)很多；
　　（2）ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c-jun與β3GnT8基因啟動(dòng)子區(qū)有相互結(jié)合；
　?。?）通過熒光顯微鏡觀察、Real time-PCR及Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SW480中 c-jun上調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，β3GnT8、HG-CD147及MMPs的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高；LoVo細(xì)胞中c-jun下調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，β3GnT8、HG-CD147及MMPs的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下

6、降；
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞表面多聚乳糖胺鏈含量增加；LoVo細(xì)胞中c-jun下調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞表面多聚乳糖胺鏈含量降低；
　　（5）細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，損傷程度變小，提示細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；而LoVo細(xì)胞中c-jun下調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，損傷程度變大，提示細(xì)胞遷移能力降低；
　　（6）Tr

7、answell小室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)；而LoVo細(xì)胞中c-jun下調(diào)后，與空白對(duì)照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低，提示細(xì)胞侵襲和遷移能力降低。
　　（7）Real time-PCR篩選獲得siβ3GnT8-1754和siβ3GnT2-1336兩個(gè)最有效干擾片段，與c-jun過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染 SW480細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染siβ3

8、GnT8-1754和siβ3GnT2-1336組相比，共轉(zhuǎn)染組β3GnT8 mRNA的表達(dá)升高，且高于未處理組；并用 Transwell檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)較 c-jun過表達(dá)組明顯減少，較單獨(dú)轉(zhuǎn)染siβ3GnT8-1754和siβ3GnT2-1336組升高。
　　結(jié)論：
　　（1）三株結(jié)腸癌細(xì)胞株中c-jun和β3GnT8的蛋白表達(dá)水平由低到高依次為SW480→SW620→LoVo。
　?。?）轉(zhuǎn)錄因子c-ju