擬南芥abi5基因的分子克隆及其在原核細胞中的表達.pdf

1、植物在生長過程中，會遇到諸如干旱、低溫和高鹽等非生物逆境脅迫，此時植物會產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，感知、傳遞逆境脅迫信號，對環(huán)境刺激作出反應(yīng)。在逆境脅迫下，植物表達的基因分為兩類：(1)功能蛋白和酶類，如LEA，抗凍蛋白，解毒酶等；(2)傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，如bZIP，MYC，DREB等，其中轉(zhuǎn)錄因子對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起至關(guān)重要的作用。植物通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程，將環(huán)境變化轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)部的信息，經(jīng)過一系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，最終

2、激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子，啟動基因的轉(zhuǎn)錄和表達來抵御外界的脅迫傷害。ABA作為一種重要的植物激素和生長調(diào)節(jié)劑，介導(dǎo)了高等植物在營養(yǎng)生長階段對各種外界環(huán)境的響應(yīng)和適應(yīng)。擬南芥ABI5是一個響應(yīng)ABA信號的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，能開啟一系列抗性相關(guān)基因的表達，在信號的傳遞、相關(guān)功能基因的表達調(diào)控以及胚胎發(fā)育階段的調(diào)控中起著重要的作用，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和對非生物脅迫的耐性。
　　 大腸桿菌因為遺傳背景清楚，代時短，易控制成為生產(chǎn)重組蛋白的主要工程

3、菌。目前在利用原核系統(tǒng)表達重組蛋白的過程中常常遇到的幾個難題是重組蛋白常常以包涵體的形式存在，表達量低和容易降解等。本研究克隆了擬南芥abi5基因，并將其連接于pET-32a載體上，構(gòu)建融合蛋白表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21系列菌株，并對其進行誘導(dǎo)表達及表達條件的優(yōu)化，主要結(jié)果如下：
　　 1.擬南芥abi5基因的分子克?。焊鶕?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的擬南芥abi5基因的cDNA序列及pET-32a載體序列設(shè)計上游引物和下游引物，

4、用PfuDNA聚合酶通過RT-PCR的方法從擬南芥RNA中擴增得到了擬南芥abi5基因。將其與克隆載體pMDR-TVector連接，得到重組質(zhì)粒，命名為pUC19-ABI5，并進行測序。測序結(jié)果表明所克隆的擬南芥abi5基因全長1323bp，總共編碼440個氨基酸。
　　 2.擬南芥abi5原核表達載體的體外構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：按照設(shè)計在引物上的內(nèi)切酶位點，用EcoRI酶切割重組質(zhì)粒pUC19-ABI5，將得到的abi5基因克隆至pET

5、-32a表達載體的多克隆位點，構(gòu)建正確的原核表達載體pET32a-ABI5，根據(jù)對其基因序列的分析，選擇經(jīng)改造的BL21Star(DE3)作為宿主細胞進行轉(zhuǎn)化，獲得BL21/pET32a-ABI5原核表達菌株。
　　 3.原核表達鑒定及表達條件的優(yōu)化：篩選陽性克隆進行原核表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明擬南芥abi5基因已經(jīng)結(jié)合在pET-32a表達載體上，并形成了融合蛋白，該蛋白可在所選原核細胞中良好表達，并主要以可溶性

6、形式存在，分子量約為67kDa。對BL21/pET32a-ABI5誘導(dǎo)表達的IPTG終濃度，溫度及誘導(dǎo)時間各條件進行了優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)各條件下目標融合蛋白均主要以可溶性形式表達。其中在實驗所設(shè)各IPTG終濃度和各溫度條件下蛋白表達量沒有明顯的差異，隨誘導(dǎo)時間的延長至9h，目標融合蛋白含量明顯下降。實驗得到目的蛋白可溶性表達的最優(yōu)條件為：IPTG終濃度為0.3mmol/L，30℃下誘導(dǎo)3h。
　　 擬南芥abi