山定子低溫脅迫轉錄因子CBF基因（MbCBF）的克隆及其在擬南芥中的轉化研究.pdf

1、低溫寒害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種嚴重自然災害，世界上每年因此造成的損失高達2000億美元。作物的抗寒性狀是由多基因控制的，只有成簇抗性相關基因的轉錄激活，才能有效提高作物的抗寒能力?？寺〔㈣b定調(diào)控抗寒功能基因表達的轉錄因子成為這一研究領域的熱點。目前已經(jīng)從多種植物中發(fā)現(xiàn)CBF(C-repeat Binding factors)冷調(diào)控轉錄因子，其功能也已得到驗證。CBF轉錄激活因子可與COR(cold-rcgulated)基因啟動子區(qū)域的CRT

2、/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)調(diào)控元件特異結合，并激活一系列COR蛋白的表達，從而提高植物的耐寒性。本文利用PCR技術，首次從抗寒植物山定子中分離低溫誘導轉錄因子CBF基因，并進行了克隆與序列分析(基因銀行注冊號碼為EF582842)；同時，構建了山定子轉錄因子CBF基因的植物表達載體，并通過花序浸泡法進行了擬南芥的遺傳轉化研究，主要的研究結果如下： 1.通過將GenB

3、ank上發(fā)表的幾種植物的CBF同源基因進行比較在其保守區(qū)域設計一對兼并引物，采用RT-PCR和常規(guī)PCR方法對山定子轉錄因子CBF基因中間片段進行克隆，得到一大小為461bp的片段，并在此中間片段基礎上設計了兩對特異引物，采用反向PCR方法對山定子轉錄因子CBF基因的旁側序列進行克隆，結果獲得一長度為1841bp的片段，與中間片段拼接得到一大小為2284bp的片段，其中包含完整的開放閱讀框從第790位的起始密碼子到第1545位的終止密碼

4、子，推測的編碼蛋白的氨基酸序列含251個氨基酸殘基。然后在預測的編碼區(qū)兩端設計一對特異引物對山定子基因組進行擴增，測序結果得到的序列與拼接所得的序列在編碼區(qū)內(nèi)完全一致。應用DNAman軟件將推測的山定子轉錄因子CBF基因編碼區(qū)與Genebank上發(fā)表的幾種植物CBF基因進行氨基酸同源性比對，結果發(fā)現(xiàn)山定子CBF轉錄因子MbCBF和櫻桃(Prunusavium)DREB基因的氨基酸同源性為66.93％；與橡膠樹(Hevea brasili

5、ensis)同源性為55％，這說明我們已經(jīng)成功地克隆了山定子轉錄因子MbCBF基因。 2.對山定子轉錄因子CBF基因的核苷酸序列以及由此推導出的氨基酸序列進行了序列比對和功能、結構分析，得出以下結論： 1) 山定子轉錄因子CBF基因與其它植物CBF基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性； 2) 山定子轉錄因子CBF基因編碼一酸性蛋白，等電點pI為5.01，預測分子量為27.9KD； 3)山定子轉錄因子CB

6、F氨基酸序列含有一個功能區(qū)AP2結合域。在AP2結合域的兩端擁有PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR兩段短多肽序列； 4)山定子轉錄因子CBF氨基酸序列擁有酸性活化區(qū)域，無核定位信號和信號肽，無跨膜結構； 5)山定子轉錄因子CBF氨基酸序列中有和CBF家族中保守的α螺旋區(qū)和β折疊區(qū)； 6)用同源建模法模擬出山定子轉錄因子CBF’的空間結構模型； 7)通過對山定子轉錄因子CBF基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出，

7、山定子轉錄因子CBF基因與蘋果屬櫻桃的DREB基因具有相近的起源。 3.構建山定子轉錄因子CBF基因的植物表達載體，即首先設計一對含有BamH Ⅰ和SacⅠ酶切位點的特異引物P5F、P5R，從山定子基因組DNA中分離CBF基因的編碼區(qū)。然后應用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對質粒pBI121和PCR產(chǎn)物進行酶切，用酶切的PCR產(chǎn)物替換質粒pBI121中的GUS基因，獲得山定子轉錄因子CBF基因的植物表達載體pBC35S。