白菜脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子BpDREB基因的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)植物的抗逆性與編碼抗逆相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)基因和信號傳遞、調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(如bZIP轉(zhuǎn)錄因子、MYC轉(zhuǎn)錄因子、DREB轉(zhuǎn)錄因子等)的表達(dá)與調(diào)控有關(guān)。多年來，對第一類基因的研究，即結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)特性、結(jié)構(gòu)與功能的研究，取得了很大的成就。但對植物細(xì)胞在受到脅迫后，如何將這些信號傳遞以及對下游基因的表達(dá)及調(diào)控等一系列分子機(jī)理了解甚少，因此，對轉(zhuǎn)錄因子的克隆、表達(dá)特性及調(diào)控作用的研究成為當(dāng)今植物抗逆分子生物學(xué)研究領(lǐng)域熱點之一。

2、 植物中存在著許多與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中脫水應(yīng)答因子(Dehydrationresponsive element binding，DREB)在干早、高鹽，及低溫脅迫信號傳遞過程中起重要作用，該類轉(zhuǎn)錄因子特異存在于植物中，屬于AP2/EREBP家族。該類轉(zhuǎn)錄因子均含有AP2/EREBP DNA結(jié)合域，具有與DRE順式作用元件結(jié)合的特異性。DRE順式作用元件的核心序列為CCGAC。研究表明在許多植物的抗逆結(jié)構(gòu)基因中都有DRE元件的核

3、心序列。DREB的過表達(dá)可以同時調(diào)控一系列抗逆基因的表達(dá)，從而提高植物細(xì)胞整體抗逆特性。因此，從克隆轉(zhuǎn)錄因子基因入手，進(jìn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物研究是提高作物抗逆性質(zhì)更為有效的方法和途徑。 本實驗首先通過GenBank、DDBJ等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫信息資源，對已登陸的DREB相關(guān)信息進(jìn)行查閱、歸納、總結(jié)分析及序列比對，設(shè)計特異引物，利用同源克隆的方法，在具有良好抗寒性的白菜秋綠60的DNA中克隆了一個DREB基因，該基因全長777bp，具有一個

4、長771bp的開放閱讀框，編碼一個256個氨基酸的多肽，含有一個保守的AP2/EREBP DNA結(jié)構(gòu)域，具有DREB亞家族成員保守的V14和E19兩個氨基酸，命名為BpDREB(Brassica rapa subsp.Pekinensis DREB)。之后，利用同樣的引物在低溫誘導(dǎo)的白菜幼苗葉片總體RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA中，也擴(kuò)增到了相同分子量的基因，測序發(fā)現(xiàn)其與DNA中序列相同，證明該基因可能是一個具有功能的基因。 為了驗證B

5、pDREB的功能，本研究將BpDREB構(gòu)建到表達(dá)載體pCAMmA1301中，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-BpDREB。用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆菌，液體培養(yǎng)至對數(shù)期，用花序?qū)敕ㄞD(zhuǎn)化擬南芥。收集轉(zhuǎn)化過的擬南芥種子，經(jīng)過低溫打破休眠后，種植在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，大多數(shù)種子及幼苗篩選過程中死去，少數(shù)生長良好的幼苗可能是轉(zhuǎn)化了外源基因的植株，移栽到培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因分子鑒定及抗性鑒定。該研究植物抗逆