幽門螺桿菌黏附素A(HpaA)胞外黏附相關(guān)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)測(cè)定.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobαcter pylori，H.pylori）選擇性地定植于宿主胃竇上皮細(xì)胞表面和胃黏液的底層，使感染得以建立和持續(xù)，細(xì)菌表面的多種膜外蛋白參與了這種定植作用。幽門螺桿菌黏附素A(H.pylori adhesin A，HpaA)是位于H.pylori鞭毛鞘或細(xì)菌表面的一種膜外蛋白，近年來，作為一種重要的保護(hù)性抗原廣泛被用于疫苗設(shè)計(jì)。HpaA屬于神經(jīng)氨酰乳糖結(jié)合凝集素前體(Neuraminyll actose-bi

2、nding hemagglutininprecursor, NLBH)家族，為定植于消化道的螺旋桿菌屬所特有，結(jié)合胃腸道上皮細(xì)胞含唾液酸基團(tuán)的大分子受體。然而，關(guān)于NLBH家族成員的文獻(xiàn)報(bào)道極少，這類蛋白的結(jié)構(gòu)和功能并不明確，自1988年首次被文獻(xiàn)報(bào)道以來，HpaA介導(dǎo)黏附與定植的功能及作用機(jī)制尚未被證實(shí)，與之相結(jié)合的胃上皮細(xì)胞受體也未被鑒定。
　　本課題的目的是解析HpaA晶體結(jié)構(gòu)。目的蛋白全長260位氨基酸，考慮到純化和結(jié)晶的

3、可行性，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，不表達(dá)蛋白跨膜區(qū)，并去除一些可能影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的柔性區(qū)域，僅表達(dá)蛋白羧基端胞外黏附相關(guān)結(jié)構(gòu)域。克隆了H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株26695的hp0797基因不同長度片段，構(gòu)建pET22b(+)-rHpaA36、pET22b(+)-rHpaA31、pET22b(+)-rHpaA53三種重組質(zhì)粒，分別表達(dá)36-260位、31-260位、53-260位氨基酸的三種長度重組蛋白，為便于純化，羧基端帶6×His標(biāo)簽。三種

4、蛋白均能在E.coli BL21(DE3)菌株中高效上清表達(dá)，純化后的蛋白以二聚體形式存在于緩沖液中，純度95％以上，但最后僅rHpaA53分別在硫酸鋰、硫酸銨沉淀劑條件下獲得的兩種晶體衍射分辨率較高。
　　在硫酸鋰條件下生長的晶體大小約800×280×60μm，衍射分辨率2.03(A)，屬六方晶系，晶胞參數(shù)α=b=95.33(A)，c=54.81(A)，γ=120°，P65空間群，一個(gè)不對(duì)稱單位中含1個(gè)分子，結(jié)合4個(gè)硫酸根離子，

5、但缺失198-213位氨基酸的電子密度。在硫酸銨條件下生長的晶體大小約70×70×30μm，衍射分辨率2.6(A)，屬正交晶系，晶胞參數(shù)α=106.31(A)，b=121.008(A)，c=190.56(A)，P22121空間群，一個(gè)不對(duì)稱單位中含8個(gè)分子，除首、尾幾個(gè)氨基酸外，電子密度無缺失，解析出完整的rHpaA53蛋白結(jié)構(gòu)。
　　對(duì)HpaA胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)解析為理解HpaA及NLBH家族發(fā)揮黏附作用的功能奠定了基礎(chǔ)，并為