環(huán)形泰勒蟲感染細(xì)胞TLR和NLR信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)與評(píng)價(jià).pdf

1、先天性免疫是宿主抵抗病原入侵的一種重要的免疫防御機(jī)制，包括免疫細(xì)胞和先天性免疫分子。先天性免疫信號(hào)通路分子在免疫防御中發(fā)揮著重要的作用，主要包括TLR信號(hào)通路、NLR信號(hào)通路、RLR信號(hào)通路和CLR信號(hào)通路。TLR信號(hào)通路主要識(shí)別細(xì)胞外的原蟲、病毒和細(xì)菌等病原，在抵抗病原入侵中發(fā)揮著重要作用。NLR信號(hào)通路主要識(shí)別胞內(nèi)抗原，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的釋放起到免疫防御作用。環(huán)形泰勒蟲可侵入淋巴樣細(xì)胞和紅細(xì)胞的原蟲，其裂殖體階段具有轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的特

2、性，業(yè)已證明主要寄生于B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞。因此，研究環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染細(xì)胞TLR和NLR信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平，不僅可以揭示環(huán)形泰勒蟲對(duì)宿主細(xì)胞天然免疫功能的影響，而且對(duì)深入開展寄生蟲致病、寄生蟲誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生永生化等病原與宿主相互作用機(jī)制研究具有重要意義。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.Real-time PCR檢測(cè)方法的建立:根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列，針對(duì)牛的Toll樣受體(TLR1-1

3、0)、NOD1、NOD2和IL6等分子設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了48種Real-time PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:所建方法熔解曲線峰單一，在不同目標(biāo)分子之間無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好;可檢測(cè)1-100 copies/μL以上的重組質(zhì)粒，敏感性好;組內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)低于3.52％，組間重復(fù)變異系數(shù)不超過(guò)3.92％。為進(jìn)一步開展牛Toll樣信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平研究提供了技術(shù)和方法。
　　2.環(huán)形泰勒蟲感染細(xì)胞T

4、oll樣受體和NOD樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)與評(píng)價(jià):采用所建立的Real-time PCR檢測(cè)方法，以健康牛外周血淋巴細(xì)胞為對(duì)照組，對(duì)環(huán)形泰勒蟲感染的TaXJ-1、TaNM和TaX J-23株淋巴細(xì)胞系的F10代次細(xì)胞的Toll樣受體和NOD樣受體信號(hào)通路上的48個(gè)分子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:TLR1-TLR10轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異極顯著(P＜0.01)，其中TLR1、TLR5、TLR7和TLR10與其他受體相比下調(diào)十

5、分明顯; NOD1、NOD2、NAIP、NLRP1和NLRC4分子轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異極顯著(P＜0.01)，NLRP3轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異顯著(P＜0.05)，其中NAIP與其他受體相比下調(diào)十分明顯，而NLRP1在實(shí)驗(yàn)組中很難檢測(cè)到;Toll樣和NOD樣受體信號(hào)通路下游接頭分子，細(xì)胞因子中僅IL6和IL1β轉(zhuǎn)錄上調(diào)，差異極顯著(P＜0.01)，且IL6上調(diào)倍數(shù)比IL1β大，其余30個(gè)分子轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異極顯著(P＜0.01)，其中ASC