AP-3調(diào)控擬南芥PAT10液泡運輸途徑和花粉管生長.pdf

1、植物液泡作為植物中特有的細(xì)胞器，通過調(diào)控離子平衡、次生代謝物質(zhì)儲存維持滲透壓等參與植物響應(yīng)環(huán)境信號、生長發(fā)育等生命過程。定位在液泡膜上的離子轉(zhuǎn)運蛋白、酶類等對于液泡發(fā)揮這些功能至關(guān)重要。這些蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后通過多條途徑到達(dá)液泡。兩條經(jīng)典的運輸途徑，經(jīng)COP??復(fù)合體介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基體后由小G蛋白Rab5或者Rab5和Rab7共同介導(dǎo)到達(dá)液泡；一條是由銜接蛋白復(fù)合體3（ Adaptor Protein Complex-3，AP-3）

2、參與的過程，但該過程的分子機理研究甚少，只有少數(shù)底物研究的報道；最新被發(fā)現(xiàn)的一條途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接靶向液泡膜的途徑，該過程的分子機理也尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶10（Protein S-Acyl Transferase10，PAT10）靶向液泡膜不受Rab5-DN的阻斷，這就暗示PAT10通過非經(jīng)典的運輸途徑靶向液泡膜。為了探究非經(jīng)典運輸途徑的參與因子以及特異性識別序列，本研究利用PAT10-GFP的材料進行了基于熒光的正向遺傳學(xué)

3、篩選、遺傳干擾、結(jié)構(gòu)域解析及創(chuàng)制嵌合蛋白等實驗，主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　?。?）PAT10經(jīng)非經(jīng)典的運輸途徑靶向液泡膜
　　經(jīng)典的運輸途徑可以被小G蛋白Rab5-DN（Dominant negative）形式阻斷，Rab5-DN形式可以競爭性的結(jié)合內(nèi)源的GEF蛋白，從而導(dǎo)致對內(nèi)源的Rab5蛋白功能的遺傳干擾。本研究首先利用細(xì)胞特異性啟動子驅(qū)動Rab5-DN的表達(dá)可以阻斷肌醇轉(zhuǎn)移載體INT1（Inositiol Transpo

4、rter1）靶向液泡膜的運輸，INT1是已知的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)高爾基的囊泡運輸途徑到達(dá)液泡膜上的跨膜蛋白。證明這種遺傳干擾確實能夠阻斷經(jīng)高爾基體的液泡運輸途徑。將Rab-5DN轉(zhuǎn)基因材料通過雜交引入PAT10-GFP植株中，通過熒光成像發(fā)現(xiàn)Rab5-DN的表達(dá)并沒有干擾PAT10在液泡膜上的定位。這暗示PAT10在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后，不經(jīng)過TGN直接到達(dá)液泡膜，即PAT10經(jīng)非經(jīng)典的運輸途徑靶向液泡膜。
　?。?）PAT10的酶活區(qū)和C端對

5、其亞細(xì)胞定位十分關(guān)鍵
　　PAT10的蛋白結(jié)構(gòu)相對簡單，包括4個跨膜區(qū)、酶活區(qū)以及N-和C-端非催化區(qū)。本研究通過體外DNA操作，對PAT10的不同結(jié)構(gòu)域進行缺失，并將GFP-融合的嵌合蛋白引入到pat10-1中。通過對pat10-1表型互補與否，亞細(xì)胞定位如何，以及對Rab5-DN及藥劑干擾的響應(yīng)等研究，我們發(fā)現(xiàn)：N端缺失的嵌合蛋白可以互補突變體的表型，不影響PAT10定位到液泡膜上，但受Rab5-DN阻斷，說明N端影響PAT1

6、0的運輸途徑；酶活區(qū)以及C端缺失的嵌合蛋白不能互補突變體的表型，定位發(fā)生改變，說明酶活區(qū)以及C端對于PAT10的功能和定位十分關(guān)鍵。
　?。?）PAT10經(jīng)AP-3途徑靶向液泡
　　為了探究PAT10經(jīng)哪條運輸途徑靶向液泡膜，以及該途徑都有哪些調(diào)控因子參與。本研究對PAT10-GFP；pat10-1的材料進行了EMS誘變，又由于花粉是單倍體，經(jīng)誘變后M0代即可表現(xiàn)出表型，并且其孢子體有一個拷貝是野生型的，可以排除孢子體對花粉

7、的影響，該方法可以顯著減少篩選的時間。本研究對PAT10-GFP；pat10-1誘變的M0植株材料的花粉管進行了PAT10-GFP定位的篩選，并且獲得了兩個突變材料，分別命名為reva1-1和reva1-2。通過圖位克隆以及測序的方法，我們發(fā)現(xiàn)reva1編碼AP-3δ亞基。將PAT10-GFP通過雜交的方法引入到AP-3δ亞基的T-DNA插入突變體pat4-2中，發(fā)現(xiàn)同reva1-1和reva1-2中結(jié)果一致，PAT10-GFP定位到高

8、爾基上。等位檢測以及互補實驗都證明PAT10經(jīng)AP-3介導(dǎo)從高爾基靶向液泡膜。
　?。?）COP??的小G蛋白SAR1參與AP-3運輸途徑
　　COPⅡ介導(dǎo)囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基的運輸過程。利用COPⅡ復(fù)合體的小G蛋白SAR1-DN可以阻斷該運輸途徑。首先利用細(xì)胞特異性啟動子驅(qū)動SAR1c-DN的表達(dá)可以阻斷INT1靶向液泡膜的運輸，證明這種遺傳干擾確實能夠阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基的囊泡運輸途徑。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白SUC4和PAT10-G

9、FP在AP-3δ亞基的突變體中的信號滯留在高爾基上（Wolfenstetter et al.,2012），這就暗示AP-3在高爾基上介導(dǎo)囊泡運輸靶向液泡。為了探究是否由COPⅡ介導(dǎo)這些蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向高爾基，本研究通過瞬時轉(zhuǎn)化體系以及雜交的手段將GFP-SUC4和PAT10-GFP引入到SAR1c-DN的材料中，發(fā)現(xiàn)SUC4和PAT10在該遺傳干擾的材料中液泡膜的信號減弱，這表明AP-3運輸?shù)牡鞍捉?jīng)COPⅡ途徑從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基。

10、r>　?。?）HOPS參與AP-3介導(dǎo)的囊泡與液泡的融合
　　酵母中的研究表明HOPS復(fù)合體參與了囊泡的融合過程。為了探究AP-3介導(dǎo)的囊泡到達(dá)液泡附近后是否由HOPS介導(dǎo)與液泡融合。本研究利用HOPS復(fù)合體的VPS41亞基的突變體進行了研究。由于vps41-1的花粉管不能傳代，不能獲得vps41-1純和突變體，所以本研究利用花粉管作為系統(tǒng)進行了PAT10-GFP定位的分析。通過熒光成像發(fā)現(xiàn)，在vps41-1花粉管中PAT10的定

11、位變成了點狀，為了排除該點狀的結(jié)構(gòu)不是變形的液泡，本研究利用化學(xué)染料Oregon Green對花粉管進行了染色以及三維重構(gòu)了花粉管中液泡，結(jié)果表明vps41-1的花粉管中液泡形態(tài)確實出現(xiàn)異常，但與PAT10以及CBL2的定位并不一致，CBL2-RFP在野生型中是液泡膜的定位，在vps41-1花粉管中的定位變成了質(zhì)膜。說明HOPS參與了AP-3介導(dǎo)的囊泡與液泡融合過程。
　　（6）AP-3介導(dǎo)的液泡融合過程調(diào)控花粉管的生長
　

12、　花粉管的生長對植物能夠成功完成有性生殖過程十分重要。液泡儲藏物質(zhì)以及蛋白的運輸和液泡的動態(tài)組裝對花粉管生長十分關(guān)鍵，但起關(guān)鍵作用的因子并不清楚。本研究中報道了銜接蛋白復(fù)合體AP-3及兩個定位在液泡膜上的蛋白在花粉管生長過程中發(fā)揮重要功能。擬南芥中AP-3調(diào)控多種蛋白質(zhì)靶向液泡膜的運輸，其中棕櫚?；D(zhuǎn)移酶10（PAT10）和SNARE蛋白VAMP711分別參與了鈣離子信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和液泡膜的動態(tài)融合過程。復(fù)合體AP-3各亞基的缺失突變會

13、影響雄配子傳代率，通過分析各亞基的突變體發(fā)現(xiàn)，AP-3功能缺失影響了花粉管體外和體內(nèi)的生長過程，而不影響花粉的發(fā)育和導(dǎo)向性生長過程。PAT10和 VAMP711功能缺失也影響了花粉的生長過程，暗示經(jīng)AP-3介導(dǎo)的PAT10和VAMP711到達(dá)液泡膜的過程對于花粉管生長至關(guān)重要。本研究中還展示了 AP-3的功能缺失影響了液泡的動態(tài)組裝過程，野生型花粉管中液泡呈現(xiàn)為管狀結(jié)構(gòu)，但突變體中管狀結(jié)構(gòu)的液泡顯著減少，并且在液泡的末端會形成球狀結(jié)構(gòu)。