蛋白質(zhì)含量的測定(folin—酚法)

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)名稱：蛋白質(zhì)含量的測定（Folin酚法）實(shí)驗(yàn)日期：實(shí)驗(yàn)日期：班級：班級：學(xué)生姓名學(xué)生姓名：研究背景與目的：研究背景與目的：蛋白質(zhì)是生物最重要的基本組成成份之一蛋白質(zhì)的定量分析方法的研究在國際上一直十分活躍，F(xiàn)olin酚法是一種靈敏度極高，可快速測定蛋白質(zhì)含量的方法，廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)掌握使用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法，同時(shí)熟練722分光光度計(jì)的使用和比色法。實(shí)驗(yàn)原理：

2、實(shí)驗(yàn)原理：Folin試劑是由兩部分組成，甲試劑相當(dāng)于雙縮脲試劑，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成絡(luò)合物。試劑乙是磷鎢酸和磷鉬酸的混合液，在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被蛋白質(zhì)和試劑甲生成的絡(luò)合物還原，生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物而呈藍(lán)色反應(yīng)。根據(jù)此試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)以及一定條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比，可用比色法，使用分光光度計(jì)，通過對呈現(xiàn)藍(lán)色的混合物進(jìn)行濃度測定，再依據(jù)比例計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。儀器與試劑：儀器與試劑：722分光光度計(jì)（

3、上海精密科學(xué)儀器有限公司）架盤天平具塞刻度試管8支15ml移液器100ul1000ul和1ml5ml容量瓶50ml1小燒杯漏斗研缽Folin酚試劑：試劑甲試劑乙250ugml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液材料：材料：綠豆芽下胚軸實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支15ml具塞刻度試管，編號(hào)。如下表所列加入相應(yīng)試劑。管號(hào)管號(hào)123456蛋白質(zhì)含蛋白質(zhì)含量（ugml）050100150200250加原液量加原液量（ml）00.20.40.60.

4、81.0加dH2O量（ml）1.00.80.60.40.20步驟一步驟一各加入試劑甲各加入試劑甲5ml，混合后在室溫下放置，混合后在室溫下放置10分鐘分鐘步驟二步驟二各加入試劑乙各加入試劑乙0.5ml立即混合均勻（速度要快）立即混合均勻（速度要快），放置半小時(shí)，放置半小時(shí)步驟三步驟三以不含蛋白質(zhì)的以不含蛋白質(zhì)的1號(hào)試管為對照，與其他號(hào)試管為對照，與其他5支試管內(nèi)的溶液依次用支試管內(nèi)的溶液依次用722分光光度計(jì)于光光度計(jì)于650nm波長下

5、比色，記錄各試管內(nèi)溶液的消光值。波長下比色，記錄各試管內(nèi)溶液的消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白含量（ugml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品測定（1）稱取綠豆芽下胚軸1g于研缽中，勻漿。轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，定容。然后過思考題：思考題：1為什么要求加入試劑乙后立即混勻？否則將會(huì)如何影響測定結(jié)果？已知試劑乙未磷鎢酸和磷鉬酸混合液，乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下極不穩(wěn)定。又知Folin－酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成

6、堿性的銅－蛋白質(zhì)溶液，所以加入試劑乙后要立即混勻，以便在在磷鉬酸－磷鎢酸試劑被破壞之前，使還原反應(yīng)發(fā)生。否則試劑乙含量減少，使得蛋白質(zhì)與試劑甲作用后的溶液不能完全反應(yīng)，以致所測蛋白質(zhì)含量偏低。2試分析本實(shí)驗(yàn)方法中的干擾因素本實(shí)驗(yàn)方法中從物質(zhì)角度分析蛋白質(zhì)中氨基酸的R基團(tuán)中的酚類物質(zhì)，豆芽中的檸檬酸、甘氨酸、各種糖以及各種還原劑等對測定均有干擾作用。從實(shí)驗(yàn)過程分析，反應(yīng)的操作時(shí)間不易控制，如：加入試劑乙后迅速混勻等。3為什么測定同一類甚至

7、同一種物質(zhì)的含量會(huì)有多種測定方法？每一種測量方法都有各自的特點(diǎn)，即各有各的優(yōu)缺點(diǎn)，如：Bradfd法和Lowry法靈敏度最高，定氮法更準(zhǔn)確，但也更加復(fù)雜。因?yàn)槟骋环N并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)含量測定，于是，我們在選擇測量方法時(shí)，要考慮實(shí)驗(yàn)對測定所要求的靈敏度和精確度，蛋白質(zhì)性質(zhì)，溶液中存在的干擾因素，測定所要花費(fèi)的時(shí)間等等方面。所以會(huì)有多種測定方法。4在Folin酚法中，試劑甲的作用是什么？試劑甲的作用是與蛋白質(zhì)中的肽鍵形