spe-hplc實驗講義

1、固相萃取固相萃取高效液相色譜法測定水溶液中的腺嘌呤核苷高效液相色譜法測定水溶液中的腺嘌呤核苷【實驗目的實驗目的】1.掌握固相萃取前處理樣品的基本步驟及方法2.熟悉高效液相色譜儀的一般使用方法【實驗原理實驗原理】固相萃?。⊿PE）分離是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，使其與樣品的基體或干擾化合物分離，然后再用適當?shù)娜軇┫闯s質，最后用適當溶劑洗脫目標化合物從而達到分離和富集目標化合物的目的。腺嘌呤核苷是生物細胞維持生命活動的基

2、本組成元素之一，參與DNA的代謝過程在體內許多系統(tǒng)和組織有著廣泛的生理學作用，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性。本實驗利用固相萃取—高效液相色譜的方法，實現(xiàn)了水溶液中的腺嘌呤核苷與其結構類相似物2’脫氧鳥嘌呤核苷，鳥嘌呤核苷，胞7嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷的定量分離。當樣品雜質雜質的極性＞目的極性＞目標物的極性，用反相模式。采用固相萃取物的極性，用反相模式。采用固相萃取C18柱。柱。洗脫洗脫劑的選擇選擇，洗，洗雜質雜質

3、、目、目標物時極性相似。目極性相似。目標物與物與雜質雜質同時吸附，而吸附，而樣品中品中雜質雜質的極性＞目極性＞目標物的極性物的極性時，先用極性大的溶，先用極性大的溶劑，將，將雜質雜質洗下來（洗下來（15％甲醇），再用極性小的溶％甲醇），再用極性小的溶劑洗脫目洗脫目標物（物（50％甲醇）。％甲醇）。必須活化，才能與溶活化，才能與溶質產質產生重生重線性。先用性。先用強溶劑預劑預洗，以消除小柱上在生洗，以消除小柱上在生產或儲存過程中可能中可能

4、帶入的入的污染物，避免在色染物，避免在色譜圖譜圖上出上出現(xiàn)與樣品無關得品無關得雜質雜質峰。反相峰。反相選甲醇。甲醇。然后再用然后再用較弱的甲醇－水，洗脫弱的甲醇－水，洗脫潤濕小柱，從而保濕小柱，從而保證樣證樣品在柱上有足品在柱上有足夠的保留與回收率。的保留與回收率。潤濕能打濕能打開卷曲在硅膠表面上的開卷曲在硅膠表面上的烷基鏈，使溶，使溶質與鍵合相之合相之間充分接觸。充分接觸。上樣溶劑：水；淋洗：：水；淋洗：5～10弱溶弱溶劑（水－（水－

5、緩沖液或甲醇－水）；洗脫沖液或甲醇－水）；洗脫劑：溶：溶劑強劑強度＞上度＞上樣溶劑，用小體，用小體積洗目洗目標產標產物。物。分別接洗脫后溶液，接洗脫后溶液，進色譜C18柱，極性小的后出柱。柱，極性小的后出柱?！緝x器和試劑儀器和試劑】高效液相色譜儀；ODS色譜柱；固相萃取儀；C18固相萃取柱；腺嘌呤核苷（A），2’脫氧鳥嘌呤核苷（2’dG），鳥嘌呤核苷（G），胞嘧啶核苷（C），尿嘧啶核苷(U)，胸腺嘧啶核苷(T)，甲醇，混合磷酸鹽緩沖液等

6、。Cy=5386.4x346.920.9992Ty=7058.9x44.4060.9997Uy=7310.8x274.2816.2樣品濃度計算樣品濃度計算各樣品濃度（μML）CU2’dGTA上樣0.3224淋洗18.3613.9810.51洗脫1.9752.7755.124Total18.3623.5719.564.5798.455【注意事項注意事項】1.在活化及萃取過程中，不要讓萃取柱變干，柱床始終保持濕潤。2.固相萃取上樣時速度不宜

7、過快，防止待測組分來不及與填料充分作用就從通道流失。3.固相萃取柱最好只用一次。因為從嚴格的意義上來說，很多物質的吸附是不可逆的，一次吸附，無法洗脫，若重復使用，可能影響下一次吸附。4.高效液相色譜在進樣時，為保證進樣準確，進樣時必須多取一些溶液，使溶液完全充滿進樣環(huán)。【思考題思考題】1.本實驗依次用10mL甲醇及10mL的純凈水流過淋洗固相萃取小柱，上樣后又依次用15%甲醇、純甲醇流過小柱，請解釋各溶劑的作用。用強溶劑10mL甲醇預洗