血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)

1、血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn),,內(nèi)容,一、重要性二、檢測(cè)內(nèi)容和方法三、血凝和血凝抑制試驗(yàn),一、重要性,動(dòng)物免疫接種已經(jīng)成為目前防御疫病傳播的首選措施，只有給動(dòng)物進(jìn)行有效的免疫接種后， 才能在產(chǎn)生一定的保護(hù)力， 從而防止疫病的侵入和蔓延。因此在畜禽生產(chǎn)過程中, 在群體接種疫苗前后對(duì)抗體水平進(jìn)行檢測(cè)， 準(zhǔn)確了解動(dòng)物疫病發(fā)生、 傳播和流行情況，掌握全市畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫抗體水平和動(dòng)物疫病保護(hù)情況， 從而更有效地采取綜合防控措施。因此，做好動(dòng)物免

2、疫抗體檢測(cè)工作有著十分重要的臨床意義和經(jīng)濟(jì)意義。,,,,,,一、重要性,,,,,,二、檢測(cè)內(nèi)容和方法,檢測(cè)內(nèi)容,,,,,,二、檢測(cè)內(nèi)容和方法,檢測(cè)方法,血凝試驗(yàn)：某種病毒的血凝素，能使雞、鵝或人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，叫做血凝試驗(yàn)，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血凝試驗(yàn) (HA) 。常見于正粘病毒、副粘病毒和某些黃病毒、痘病毒等。 目的：測(cè)定病毒的血凝效價(jià)，采用一定的病毒量，通常采用4個(gè)血凝單位,用已知抗原來(lái)檢測(cè)被檢血清中

3、有無(wú)相應(yīng)的特異性抗體和滴定該特異性抗體的水平。,三、血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)（禽流感和雞新城疫）,刺突：亞型特異性抗原，易變異,血凝素（HA，從H1—H15):呈柱狀 功能：①吸附細(xì)胞：與細(xì)胞上受體結(jié)合,使病毒　　　　　　　侵入細(xì)胞②凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞（血凝試驗(yàn)）③具抗原性：其抗體能中和病毒---中和抗體 　抑制血凝（血凝抑制試驗(yàn)）,血凝抑制試驗(yàn)：當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒

4、或其血凝素，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血凝試驗(yàn) (HI) 。該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法。 目的：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用雞群有無(wú)病毒感染和監(jiān)測(cè)雞的免疫狀態(tài)。,三、血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)（禽流感和雞新城疫）,血凝試驗(yàn)（HA)原理：,,血凝抑制試驗(yàn)（HI）原理 病毒的懸液中加入特

5、異性抗體，紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象被抑制，稱為紅細(xì)胞的血凝抑制。,？,,,+,,主要實(shí)驗(yàn)器材：,微量移液器,○普通離心機(jī),微量振蕩器,禽用采血器,96孔血凝反應(yīng)板,試驗(yàn)主要試劑：,標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清與待檢血清1%雞紅細(xì)胞懸液（阿氏液）四單位抗原生理鹽水（PBS液）,阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69

6、kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?1%紅細(xì)胞的配制：,1.為避免有些雞只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)最好選擇采取3只SPF雞或未進(jìn)行過任何免疫過的成年公雞血液。（抗凝劑與血液比例為1:4）2.采血完畢后將血加入至10ml離心管中，加3-4倍體積生理鹽水以2000~3000r/min，5~10min離心3-5次。3.棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使

7、紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。,4.吸取壓積紅細(xì)胞泥與生理鹽水以1:99進(jìn)行配制1%雞紅細(xì)胞懸液。5.在加紅細(xì)胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細(xì)胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細(xì)胞。6.制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。,四、血凝試驗(yàn)操作步驟,,倒加,血凝試驗(yàn)操作步驟,4個(gè)100%血凝單位（即4HA100）抗原的稀釋倍數(shù)=使100%紅細(xì)胞凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)

8、/4,結(jié)果判定1.在各組對(duì)照均正確的情況下，按下列標(biāo)準(zhǔn)判定 血凝反應(yīng)強(qiáng)度示意圖“4＋” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時(shí)不整齊或皺縮?！?＋” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”?！?＋” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點(diǎn)狀。“＋” 紅細(xì)胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒?！埃?紅細(xì)胞均沉于孔底呈小圓點(diǎn)狀，邊緣整齊。2.對(duì)照孔

9、正常的情況下，紅細(xì)胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價(jià)的終點(diǎn)。凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價(jià)。,,四單位抗原是血凝抑制試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，其準(zhǔn)確性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要的影響?？乖瓭舛雀邥r(shí)，HI抗體效價(jià)就會(huì)降低；反之則會(huì)有所升高?？乖r(jià)測(cè)量是否準(zhǔn)確，決定了配制而得的四單位抗原準(zhǔn)確性。,血凝抑制試驗(yàn)操作步驟,血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定：,以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度（注：看結(jié)果時(shí)96孔板傾斜45度）。注