第二章 生物反應動力學 1 酶促反應

1、第二章 生物反應動力學,生物反應動力學：是研究生物反應速率和各種因素對反應速率影響的的科學。,􀂄生物反應,酶促反應,細胞培養(yǎng),,第二章 生物反應動力學,第一節(jié) 酶促反應動力學第二節(jié) 細胞生長過程動力學,?本章要求： 掌握簡單酶催化反應動力學、有抑制的和復雜的酶催化反應動力學，掌握影響酶催化反應速率的因素，以及動力學參數(shù)的求取。 了解微生物反應過程的計量學，掌握分批培養(yǎng)時細胞生長動力學、底物消耗

2、及產(chǎn)物生成動力學，學會細胞反應動力學參數(shù)的估算。,第一節(jié) 酶促反應動力學,1.1 酶促反應動力學概述1.2 均相酶促反應動力學1.3 有抑制的酶催化反應動力學1.4 影響酶催化反應的因素,酶促反應是生物反應的基礎，從酶促反應可獲知： （1）酶催化反應機制；􀀹 （2）對酶促反應速率的規(guī)律進行定性或定量的描述，建立可靠的反應動力學方程，從而確定適宜的操作條件。,1.1 酶促反應動力學概述,1.1

3、.1 在生物反應器中使用的催化劑,1.1.2 酶的應用特點,酶是以活力、而不是以質(zhì)量購銷的。 酶有不同的質(zhì)量等級：工業(yè)用酶、食品用酶、醫(yī)藥用酶。 酶在實際應用中應注意，沒有必要使用比工藝條件所需純度更高的酶。,經(jīng)典酶學研究中，酶活力的測定是在反應的初始短時間內(nèi)進行的，并且酶濃度、底物濃度較低，且為水溶液，酶學研究的目的是探討酶促反應的機制。 工業(yè)上，為保證酶促反應高效率完成，常需要使用高濃度的酶制劑和底物，

4、且反應要持續(xù)較長時間，反應體系多為非均相體系，有時反應是在有機溶劑中進行。,1.1.3 酶促反應的特征,常溫、常壓、中性范圍（個別除外）下進行反應；與一些化學反應相比，省能且效率較高；專一性好；反應體系較簡單，反應過程的最適條件易于控制等。,優(yōu)點：,不足：,多限于一步或幾步較簡單的生化反應過程；一般周期較長。,1.1.4 研究酶促反應的目的,對工程技術(shù)人員而言，僅用于解釋酶促反應的機制是不夠的，還應對影響其反應速率的因素進行定

5、量分析，建立可靠的反應速率方程式，為反應器的合理設計合反應過程的最佳條件選擇服務。,􀂄均相酶反應：系指酶與反應物系處于同一相—液相的酶催化反應，它不存在相間的物質(zhì)傳遞。􀂄非均相酶反應：系指酶與反應物系處于不同相的酶催化反應，反應過程存在相間的物質(zhì)傳遞。,1.2 均相酶促反應動力學,1.2.1 酶促反應動力學基礎,酶促反應速率的影響因素,,濃度因素：酶濃度、底物濃度、產(chǎn)物濃度、效應物濃度。,內(nèi)部因

6、素(結(jié)構(gòu)因素)：底物或效應物的結(jié)構(gòu)、酶的結(jié)構(gòu)。,外部因素(反應環(huán)境)：溫度、pH、離子強度、溶劑介電常數(shù)。,1 影響酶促反應速率的因素,根據(jù)酶促反應速率與底物濃度之間關系，利用化學反應動力學方法建立相應動力學方程：􀂄零級反應􀂄一級反應􀂄二級反應􀂄連鎖的酶促反應,1.2.1 酶促反應動力學基礎,2 反應方程的建立,1.2.1 酶促反應動力學基礎,酶促反應與

7、底物濃度無關。,式中：CA－底物濃度， CB－產(chǎn)物濃度。 rmax －最大反應速率,3 零級反應,1.2.1 酶促反應動力學基礎,4 一級反應,式中：k1－一級反應速率常數(shù) CA0－底物A的初始濃度 CB－t時刻產(chǎn)物B的濃度,反應速率與底物濃度一次方成正比。,1.2.1 酶促反應動力學基礎,5 二級反應,式中：k2－二級反應速率常數(shù)

8、 CA0，CB0－底物A和B的初始濃度 CD－t時產(chǎn)物D的濃度,積分,1.2.1 酶促反應動力學基礎,6 鏈鎖酶促反應過程,A的初始濃度CA0，B、D的初始濃度為0，且CA+CB+CD=CA0,式中：k1、k2－反應速率常數(shù) CA、CB、CD－A、B、D的濃度,,,【例2-1】 卵狀假單胞菌在分批式反應中先將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟莾?nèi)脂，再轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，此反應為一級反應，反應式如下：,求中間

9、產(chǎn)物（葡萄糖內(nèi)脂）濃度達到最大時所需時間tmax及其最大濃度值CLmax，已知反應常數(shù)k1和k2分別為0.87/h和0.7/h。CG0(初始G濃度)＝38mg/ml,葡萄糖內(nèi)脂,葡萄糖,葡萄糖酸,解：,當L物達到最大值時,t=0： CG0 0 0,t=t： CG CL CP,1.2.2 簡單的酶催化反應動

10、力學,指由一種反應物（底物）參與的不可逆反應，例如酶催化的水解反應和異構(gòu)化反應。 可以寫為：,,,,其反應機理可以認為是：首先是底物S和酶E相結(jié)合形成中間復合物[ES]，然后該復合物分解成產(chǎn)物P，并釋放出酶E。即有： S+E→[ES] →P+E,上述反應的速率可表示為：,式中：rs—底物S的消耗速率，mol/(L?S) rp—產(chǎn)物P的生成速率，mol/(L?S) v—反應體系的體積，L

11、 ns ，np—分別為底物S和產(chǎn)物P的物質(zhì)的量，mol Cs ，Cp—分別為底物S和產(chǎn)物P的濃度，mol /L t—時間，s,由于中間復合物[ES]的濃度C[ES]為一難測定的未知量，因此不能用它來表示最終的速率方程。為此，需用反應體系中的可測量來代替該未知量。這樣得到的反應速率方程可以用來描述反應的進程，知道隨著反應的進行各組分濃度的變化情況，據(jù)此可以設計相關的反

12、應器。,根據(jù)質(zhì)量作用定律，P的生成速率可表示為：,對于上述反應，我們假設：（1）反應過程中，酶濃度保持恒定，即 （2）與底物濃度Cs相比，酶的濃度是很小的，因而可忽 略由于生成中間復合物[ES]而消耗的底物。 （3）產(chǎn)物的抑制作用可以忽略。,,有兩種推導反應速率方程的方法：平衡假設法和擬穩(wěn)態(tài)假設法。,平衡假設：1913年， Michaelis-Menten認為酶催化反應歷程中，生成產(chǎn)物一步的反應速率要慢于底物S和酶形成中間復合物

13、的可逆反應速率，因此生成產(chǎn)物一步的反應速率決定整個酶催化反應的速率，生成復合物的可逆反應則達到平衡狀態(tài)。,1.2.2.1 平衡假設法—Michaelis-Menten方程,根據(jù)假設有： r=rp= k+2C[ES]根據(jù)生成復合物的可逆反應有：,,,,,k+1CECS= k-1C[ES]∵CE0=CE+C[ES],∴,該方程中引入了兩個參數(shù)：KS=k-1/k+1 ——解離常數(shù)rP,max=k+2CE0rP,max —— P的

14、最大生成速率,mol/L.s,,,,最后一式即為M-M方程。 M-M方程是一個兩參數(shù)方程。當從中間復合物生成產(chǎn)物P的速率與其分解成酶和底物的速率相當時，M-M方程不適用。,,1.2.2.2 Briggs-Haldane 方程,,當從中間復合物生成產(chǎn)物的速率與其分解成酶與底物的速率相差不大時，米氏方程的平衡假設不適用。1925年，Briggs-Haldane提出了擬穩(wěn)態(tài)假設：即中間復合物的濃度不再隨時間而變化，即：,,這就是“擬穩(wěn)

15、態(tài)”假設。這是從反應機理推導動力學方程又一重要假設。,,根據(jù)反應機理和擬穩(wěn)態(tài)假設，有下述方程式：,,,,∵CE0=CE+C[ES],∴,,,,,,,,,該方程中引入了兩個參數(shù)：,rP,max=k+2CE0,rP,max —— P的最大生成速率,mol/L.s最后一式即為B-H方程。,,,,M-M方程與B-H方程比較,在具體應用時，人們亦將B-H方程稱為M-M方程。一律表示為:,,上述B-H方程好M-M方程推導中，都假設CE0＜＜CS0

16、，因而C[ES]值也很小，如果酶的濃度較高時，C[ES]值在反應過程中有可能很高，如果按上述的簡化處理會帶來誤差，此時，物料平衡和速率方程可表示為：,,CE0=CE+C[ES]CS0=CS+C[ES]+CP,,,,對此方程組一般得不到解析解，只能得到數(shù)值解。,,1.2.3 米氏方程動力學特征,,?當CS,Km接近時，呈混合級反應，則符合M-M關系。,?當CS＜＜Km時，,一級反應。,?當CS＞＞Km時，,r≈rp,max 零級反應。

17、,Km和rmax的意義,① 當r=rmax/2時，Km=CS。因此，Km等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。,② 當k-1>>k+2時，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶與底物親和力的大小，即Km值越小，則酶與底物的親和力越大；反之，則越小。,③ Km可用于判斷反應級數(shù)：當CS 100Km時，r=rmax，反應為零級反應，即反應速度與底物濃度無關；當0.01Km< CS <100Km時，反

18、應處于零級反應和一級反應之間，為混合級反應。,Km和rmax的意義,⑤ Km可用來判斷酶的最適底物：當酶有幾種不同的底物存在時，Km值最小者，為該酶的最適底物。,④ Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）的Km值，來判斷是否為不同的酶。,⑥ Km可用來確定酶活性測定時所需的底物濃度：當CS =10Km時，r=91% rmax，為最合適的測定酶活性所需的底物濃度。,⑦ rma

19、x可用于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的計算：當酶的總濃度和最大速度已知時，可計算出酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，即單位時間內(nèi)每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。,[例2-2] 有一均相酶催化反應，Km值為2×10-3mol/L，當?shù)孜锏某跏紳舛菴S0為1×10-5mol/L時，若反應進行1min，則有2％的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。試求出：(1) 當反應進行3min，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的百分數(shù)是多少? 此時底物和產(chǎn)物的濃度分別是多少?(2) 當CS0為1

20、×10-6mol/L時，也反應了3min，底物和產(chǎn)物的濃度又是多少?(3) 最大反應速率rmax值為多少?,解： (1) 根據(jù)題意，CS0＜0.01Km，此時一般認為可按一級反應處理。其動力學方程可表示為：,因為 已知t=1min時,Xs=0.02所以 CS=CS0(1-XS)=1×10-5(1-0.02)=0.98×10-5mol/L 將已知數(shù)據(jù)帶入上式中，求得 K=0.0202min-1

21、 當t=3min時，可以求得 CS=0.94×10-5mol/L，XS=6%，CP=6×10-7mol/L(2) CS0=1×10-6mol/L時，仍可視為一級反應，所以當t=3min時，同樣可以求得Xs=6%，CS=0.94×10-6mol/L，CP=6×10-8mol/L(3) 根據(jù)K=rmax/Km=0.0202 min-1得rmax=KKm=4.04

22、5;10-5mol/(L?min),【例2-3】某酶催化反應，其Km=0.01mol/l 。為了求其最大反應速率rmax值，現(xiàn)通過實驗測得該反應進行到5min時，底物已轉(zhuǎn)化了10%，已知CS0=3.4×10-4mol/l,并假定該反應可用M-M方程表示。試求： （1）最大反應速率rmax為多少？ （2）反應15min后，底物濃度為多少？,可得：rmax=2.72×10-4代入t=15min， 可知 CS=2.3

23、4×10-4,解：,將數(shù)據(jù)代入,積分得,,1.2.4 動力學常數(shù)的計算,要建立一個完善的動力學方程，必須用動力學實驗確定其動力學參數(shù)。對M-M方程，就要確定rmax=k+2CE0和Km 值，由于M-M方程為一非線性方程，無法直接通過作圖法求取。為此要對方程進行線性化處理。不同的線性化處理方法，就是不同的參數(shù)求取方法。使用時依據(jù)所得數(shù)據(jù)選擇適宜的方法。下面介紹幾種常用的方法。,將M-M方程取其倒 數(shù)得到

24、下式：,以1/rs對1/Cs作圖得一直線見圖，該直線斜率為Km /rmax， 直線與縱軸交于1 /rmax ，與橫軸交于-1 /Km ，此法又稱雙倒 數(shù)圖解法。,1.2.4.1 Lineweaver-Burk法（簡稱L-B法），,以Cs/rs對Cs作圖，得一斜率為1/rmax的直線，直線與縱軸交點 為Km/rmax,與橫軸交點為-Km。,1.2.4.2 Hanes-Woolf法（簡稱H-W法),將式兩邊均乘以Cs得:,,,以rs對rs

25、/Cs作圖，得一斜率為-Km的直線，與縱軸交 點為rmax，與橫軸交點rmax/Km。,1.2.4.3 Eadie-Hofstee法(簡稱E-H法)。,將M-M方程重排為：,1.2.4.4 積分法：,,【例2-4】在常溫下利用蔗糖酶水解蔗糖，蔗糖初始濃度CS0＝1.0mmol/L，酶的初始濃度CE0=0.01mmol/L，在實驗室反應器內(nèi)進行分批式操作，測定如下表中前兩行的數(shù)據(jù)。,試確定可否用米氏方程來描述該反應速率，若可以，求km

26、和k+2,解：首先將米氏方程轉(zhuǎn)換為：,,其中：,積分得：,,,由已知數(shù)據(jù)計算,和,結(jié)果畫圖，若方程與數(shù)據(jù)符合，應為直線。其斜率k1=k+2/Km，k2=-1/Km。由圖可以看出，已知數(shù)據(jù)可以用米氏方程來描述該反應。直線斜率等于1，截距等于-5.08，即Km=0.197mmol/L，k+2=19.7/h,實際酶促反應中，往往關心反應時間與底物轉(zhuǎn)化率的關系。,當t=0時，CS=CS0,,,,【例2-5】將底物和酶加入到分批式反應器中，經(jīng)反

27、應，底物轉(zhuǎn)化率為90%，空時為多少？已知反應速率方程式為：,酶濃度為0.001mol/L，底物濃度為2mol/L。,空時：底物在反應器中停留時間?？账伲嚎諘r的倒數(shù)，又稱稀釋率。,解：,當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率為90%時，,1.3 有抑制的酶催化反應動力學,實際情況：? 底物濃度過高反使反應速率下降；? 由于外源化合物的存在，使得反應速率下降；? 有些反應，當產(chǎn)物濃度達到一定值后會使反應速率下降。這些情況就是所謂的抑制作用。,,不可逆抑制

28、：如果抑制劑與酶的基團成共價結(jié)合，則此時不能用物理方法去掉抑制劑。此類抑制可使酶永久性地失活。例如：重金屬離子對木瓜蛋白酶的抑制作用。,可逆抑制： 可用諸如透析等物理方法把抑制劑去掉而恢復酶的活性，此時酶與抑制劑的結(jié)合存在著解離平衡的關系。包括：競爭性抑制，非競爭性抑制，反競爭性抑制，混合型抑制，底物抑制和產(chǎn)物抑制。,抑制作用,,抑制劑對酶促反應速率的影響,若在反應體系中存在有與底物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)，該物質(zhì)也能在酶的活性部位上結(jié)合，從

29、而阻礙了酶與底物的結(jié)合，使酶催化底物的反應速率下降。這種抑制稱為競爭性抑制，該物質(zhì)稱為競爭性抑制劑。,1.3.1 競爭性抑制動力學,抑制劑與底物競爭酶的活性部位，當抑制劑與酶的活性部位結(jié)合之后，底物就不能再與酶結(jié)合，反之亦然。 在琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸為延胡索酸時，丙二酸是其競爭性抑制劑。,競爭性抑制主要特點：,競爭性抑制,競爭性抑制反應機理：,采用穩(wěn)態(tài)法推導動力學方程：,,解方程組，得：,式中:,令,可變形為:,可以看出，競爭

30、性抑制動力學的主要特點是米氏常數(shù)值的改變，rmax不受競爭性抑制劑的影響。由于有抑制劑的存在，須有較高的基質(zhì)濃度，才能維持一定的rmax值。,,KI—抑制劑的解離常數(shù) （mol/l）K'm—有競爭性抑制時的米氏常數(shù)（mol/l）,抑制程度取決于CS，CI，Km和K'm，當CI增加，或KI減小，都會使K'm值增大，使酶與底物的結(jié)合能力下降，活性復合物減少，因而使底物反應速率下降。若CI不變，增加CS ，抑制程度降

31、低；若CS不變，增加CI ，抑制程度增加。在一定的CS和CI條件下，KI值越低，抑制程度越大。,競爭性抑制動力學的主要特點：,競爭性抑制的Cs-r關系圖,,,,競爭性抑制的雙倒數(shù)方程式,競爭性抑制的L-B圖,,抑制劑的解離常數(shù),由此可看出，KI愈小，表明抑制劑與酶的結(jié)合力愈強，對酶催化反應能力的抑制作用就越強。,,,以K'm對CI作圖，據(jù)此圖可求出Km和KI值,例2-6：在一定的酶濃度、pH和溫度條件下，沒有抑制劑時，酶催化反的

32、反應速率為r0；當抑制劑濃度為5×10-3M時，酶反應速率為rsI，底物濃度與對應的反應結(jié)果如下表，求Km、 K'm 、rmax值。,解：根據(jù)數(shù)據(jù)作圖。,,,,,,,,,,,,有抑制劑時，抑制作用為競爭性抑制。,若抑制劑可以在酶的活性部位以外與酶相結(jié)合，并且這種結(jié)合與底物的結(jié)合沒有競爭關系，這種抑制稱為非競爭性抑制。,1.3. 2 非競爭性抑制動力學,抑制劑既可與游離的酶相結(jié)合，也可以與復合物ES相結(jié)合，生成了底物—酶

33、—抑制劑的復合物SEI。 絕大多數(shù)的情況是復合物SEI為一無催化活性的端點復合物，不能分解為產(chǎn)物，即使增大底物的濃度也不能解除抑制劑的影響。 還有一種是三元復合物SEI也能分解為產(chǎn)物，但對酶的催化反應速率仍然產(chǎn)生了抑制作用。 如核苷對霉菌酸性磷酸酯酶的抑制屬于非競爭性抑制。,非競爭性抑制特點,非競爭性抑制,非競爭性抑制反應機理,穩(wěn)態(tài)法推導動力學方程：,,,解方程組，得,式中:,可變形為:,令,對非競爭性抑制，

34、由于抑制劑的作用使最大反應速率降低了 倍，并且增加CI、KI減小都使其抑制程度增加。此時rS對CS的關系如圖。,,以 作圖，可得一直線，并求出Km和 r’max值。,,,根據(jù)L—B作圖法，上式可整理成,,又根據(jù)式,可通過實驗測得不同CI下的r’max，進而確定KI值。,競爭性抑制，隨著底物濃度的增大，抑制劑的影響可減弱； 非競爭性抑制，即使增大底物濃度也不能減弱抑制劑的影響。從這個

35、意義上說，競爭性抑制作用是可逆的，非競爭性抑制作用是不可逆的。,非競爭性抑制與競爭性抑制的主要不同點：,反競爭性抑制的特點是抑制劑不能直接與游離酶相結(jié)合，而只能與復合物ES相結(jié)合生成SEI復合物。,1.3. 3 反競爭性抑制動力學,反競爭性抑制反應機理,,,,據(jù)擬穩(wěn)態(tài)假設和物料平衡，經(jīng)整理后可得其速率方程為,式中：,以 rS 對CS作圖,,據(jù)L—B作圖法，方程為,,,,,,直線斜率為,與縱坐標交點為,與橫坐標交點為,在不同的CI濃度下得

36、一系列平行線。,線形混合型的最簡單機制可表示為：,,1.3.4 線性混合型抑制動力學,以上基本上與非競爭性抑制的模型相同，不同的是，當EI與S結(jié)合生成SEI時，由于抑制劑的存在影響了EI與S的結(jié)合，因而其解離常數(shù)由KS變?yōu)?，同樣ES與I結(jié)合時，其解離常數(shù)由KI變 為 。,,,,,,,,,上式中：,根據(jù)上述機理式，可推出其速率方程為,,,,,,對此種抑制，,式中 為KS和KI的修正系數(shù)。當 ，

37、 時，上述抑制實為非競爭性抑制。,例2-7：某酶的Km值為4.7×10-5 mol/L ，如果rmax值為2.2×10-5mol/L·min，在底物濃度為2×10-4mol/L和在（1）競爭性抑制劑與（2）非競爭性抑制劑的濃度均為5×10-4mol/L情況下，其反應速率分別為多大？假定在上述情況下KI值均為3×10-4mol/L，則在上述兩種抑制情

38、況下的抑制程度各有多大？,,,解：（1）對競爭性抑制，可列出下式,,,,（2）對非競爭性抑制，可列出下式,mol/L·min,,,（3）求抑制程度,當無抑制劑存在時的反應速率為,mol/L·min,,,所以上述兩種抑制的抑制程度應分別為,競爭性抑制,非競爭性抑制,酶促反應中，有時隨產(chǎn)物濃度提高，產(chǎn)物與酶形成復合物，阻礙了底物與酶的結(jié)合，從而降低了酶促反應的速度。,1.3. 5 產(chǎn)物抑制,反應機理：,其中EP為無活性

39、的端點復合物,,,穩(wěn)態(tài)法推導動力學方程:,,解方程組,得：,式中:,稱為產(chǎn)物抑制解離常數(shù)。,與無抑制相比較，最大反應速率值rmax不變，米氏常數(shù)增大了 倍，同競爭性抑制一樣，使反應速率下降。,對于某些酶促反應，當?shù)孜餄舛容^高時，反應速率呈下降趨勢，稱為底物抑制。,1.3.6 底物抑制,底物抑制反應機理：,快速平衡法推導動學方程：,,,,,解方程組,得：,式中:,KSS為底物抑制的解離常數(shù)mol/l,當?shù)孜镆种?/p>

40、時，r與CS的關系表示在圖中。,速率曲線有一最大值，即為最大底物消耗速率。相對應的底物濃度值可通過下式求出。在點（ ）處可微分且有極值，則 為最佳底物濃度,,,,,,1.4 影響酶催化反應的因素,內(nèi)部因素：包括酶的結(jié)構(gòu)特性和底物的結(jié)構(gòu)特性。,外部因素：包括各種物質(zhì)的濃度因素（例如酶的濃度、底物和產(chǎn)物的濃度、抑制劑的濃度等）和操作條件(如：溫度、壓力、離子強度、pH值等）。,,內(nèi)部因

41、素是由反應體系所決定的，這不是本門課程討論的內(nèi)容。本節(jié)重點討論對酶催化反應速率最明顯的兩個因素，即 PH值和溫度。,􀂄對酶促反應的影響有兩方面的含義：􀀹(1) 酶穩(wěn)定性的影響􀀹(2) 對酶活性的影響,1.4.1 pH的影響,酶分子上有許多酸性和堿性的氨基酸側(cè)鏈基團，如果酶 要表示其活性，則這些基團必須有一定的解離型式。隨著pH的變化，這些基團可處在不同的解離狀態(tài)，而具有催化活性的