hplc原理與應(yīng)用

1、高效液相色譜法,化學(xué)化工學(xué)院,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異，因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而實(shí)現(xiàn)分離的目的,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,3.操作條件的選擇—流動(dòng)相的選擇,流動(dòng)相要求：(1)溶劑應(yīng)當(dāng)是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性；(2)溶劑的性能與使用的檢測(cè)器應(yīng)當(dāng)匹配；選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止

2、波長(zhǎng)要長(zhǎng)，甲醇：205nm; 乙腈：190nm (3)溶劑對(duì)樣品應(yīng)有足夠的溶解能力；(4)溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)；(5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑。,常用流動(dòng)相溶劑：,反向色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度H2O<甲醇<乙腈<丙醇<異丙醇<四氫呋喃最常用組成：甲醇/ H2O 、 乙腈/ H2O洗脫順序：極性物質(zhì)先洗脫下來正想色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度正乙烷<乙醚<乙酸乙酯<

3、;異丙醇,洗脫方式—等度洗脫、梯度洗脫,等度洗脫： 整個(gè)洗脫過程中，流動(dòng)相的組成比保持不變梯度洗脫： 在一個(gè)分析周期中，按照一定的時(shí)間程序連續(xù)或階段性的改變流動(dòng)相的組成比，從而改變?nèi)軇┑臉O性、離子強(qiáng)度、pH值等，使每個(gè)組分在適宜的條件下獲得分離。梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)： 改善峰型；提高柱效；減少分析時(shí)間；使強(qiáng)滯留組分不容易殘留在柱子。,梯度洗脫裝置,二元高壓梯度：先加壓后混合 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑

4、按一定的比例輸入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,一臺(tái)高壓泵，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或者多種 不同極性的溶劑按一定比例抽入高壓泵中混合,四元低壓梯度：先混合后加壓,4.HPLC在各領(lǐng)域的主要應(yīng)用,1.環(huán)境:多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、酚類化合物、鄰苯二甲酸脂等。2.食品:食品營(yíng)養(yǎng)成分分析、食品添加劑分析、食品污染物分析。3.醫(yī)藥:合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物、黃胺類藥等；天然藥物：鑒別中藥真?zhèn)位蛘弋a(chǎn)地、吲哚堿、鴉片堿、強(qiáng)心甙測(cè)定

5、等。4.農(nóng)藥:有機(jī)農(nóng)藥、除草劑等。5.化工:無機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料等。,1.環(huán)境保護(hù)——多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖,1.環(huán)境保護(hù)——苯及其衍生的分離譜圖,2.食品分析中的應(yīng)用—食品營(yíng)養(yǎng)成分分析,啤酒中的有機(jī)酸分析,2.食品分析中的應(yīng)用—食品營(yíng)養(yǎng)成分分析,2.食品分析中的應(yīng)用—食品添加劑分析,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用—抗生素的測(cè)定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用—復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA的測(cè)定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用—中藥白

6、鮮皮的指紋圖譜,不同地區(qū)的白鮮皮指紋圖譜考察,A吉林仁和 B黑龍江 C哈爾濱 D上海 E長(zhǎng)沙 F承德圍場(chǎng) G西安 H烏魯木齊,4.化工中的應(yīng)用—24種禁用偶氮染料色譜圖,4. HPLC發(fā)展前景,固定相的發(fā)展前處理方法檢測(cè)器的發(fā)展聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,4. HPLC發(fā)展前景—固定相的發(fā)展,固定相基質(zhì) 高純硅膠微球聚合物微球有機(jī)-無機(jī)復(fù)合物氧化鈷微

7、球多孔石墨微球,鍵合及改性技術(shù)立體保護(hù)鍵合固定相包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相全氟烷基鍵合聚合物涂覆改性,高純硅膠基質(zhì)固定相,硅膠除了具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、容易控制的孔結(jié)構(gòu)和比表面積、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及專一的表面化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn), 還有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是其表面含有豐富的硅羥基, 這是硅膠可以進(jìn)行表面化學(xué)鍵合或改性的基礎(chǔ)。突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來改變分離的選擇性。,化學(xué)鍵合的種類,按

8、鍵合官能團(tuán)的極性分：極性和非極性鍵合。極性鍵合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。 非極性鍵合相：各種烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。,硅膠鍵合固定相的應(yīng)用,10種混合物在大黃酸鍵合硅膠固定相 (a)和C18 (b)的色譜圖,聚合物基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)：色譜選擇性好樣品容量較大化學(xué)穩(wěn)定性好不易產(chǎn)生非特異性吸附不足：剛性不理想、孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜、溶脹或收縮,多孔石墨化碳固定相,

9、特點(diǎn)：穩(wěn)定性好-在低或高pH條件下抑制酸堿離子極性樣品具有較強(qiáng)的保留異構(gòu)體選擇性提高可分離旋光異構(gòu)體可進(jìn)行族分離流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單,氧化鈷基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好強(qiáng)堿分析速度快高溫快速分析,,優(yōu)點(diǎn)：高比例水流動(dòng)相，不會(huì)導(dǎo)致烷基鏈?zhǔn)湛s極性化合物(包括酸和堿性化合物)保留增強(qiáng)傳統(tǒng)C18／C8固定相選擇性不同 可用低濃度緩沖溶液作流動(dòng)相，以及固定相官能團(tuán)低流失，適合于LC/MS,包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相,包埋極性基團(tuán)

10、鍵合相作用機(jī)理,溶質(zhì)與極性基團(tuán)的作用；溶質(zhì)和硅羥基與極性基團(tuán)的競(jìng)爭(zhēng)作用；極性基團(tuán)增加表面層水濃度,氟烷基鍵合固定相,特點(diǎn)：在與 C18/C8 相似的流動(dòng)相條件下，選擇性改善鹵代化合物和芳香異構(gòu)體的保留更強(qiáng)分離含羥基、羧基、硝基和其它極性基團(tuán)化合物具有顯著優(yōu)勢(shì),4. HPLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,,固相萃取,固相萃取,優(yōu)點(diǎn)：同步實(shí)現(xiàn)富集和純化應(yīng)用范圍： 水中有機(jī)污染物的痕量富集、水中半揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定及大氣和土

11、壤樣品的前處理,4. HPLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,分散液液微萃取,分散液液微萃取,特點(diǎn)： 有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高應(yīng)用范圍： 適用于水溶液中有機(jī)物的提取，如有機(jī)磷農(nóng)藥、酚類物質(zhì)等。也可用于水溶液中重金屬( 鈀 鈷 鉛 釩 有機(jī)錫等)的萃取。,4. HPLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,固相微萃取： 在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來，采用一根聚合物涂層的熔融石英纖維，從樣品基質(zhì)中或樣品上方的頂空氣體中直接吸附萃取待測(cè)物，

12、然后再色譜進(jìn)樣口解吸、分析。優(yōu)點(diǎn)： 所需樣本量少,避免了乳化現(xiàn)象,回收率高， 重現(xiàn)性好,而且便于自動(dòng)化操作。,4. HPLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,超臨界流體萃取： 利用超臨界流體的溶解能力與超臨界流體具有與流體相近的密度和與氣體相近的豁度，擴(kuò)散系數(shù)為液體的10倍至100倍，對(duì)很多物質(zhì)有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力。優(yōu)點(diǎn)： 提取過程快速、簡(jiǎn)便，消除有機(jī)溶劑對(duì)人體和環(huán)境的危害，并可與許多分析儀器聯(lián)用。,4. H

13、PLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,微波輔助萃取： 在微波中，由于吸收微波能力的差異使基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取習(xí)題的某些組分被選擇性的加熱，從而使樣品中要分析的組分從樣品基質(zhì)中滲出，實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)的分離。優(yōu)點(diǎn)： 受溶劑親和力影響小，設(shè)備簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重現(xiàn)性好，節(jié)省時(shí)間和溶劑。,4. HPLC發(fā)展前景—樣品前處理方法,濁點(diǎn)萃取： 以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親

14、水性物質(zhì)分開。優(yōu)點(diǎn)： 萃取率高、富集因子大、操作簡(jiǎn)便、安全、經(jīng)濟(jì)，便于實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。,4. HPLC發(fā)展前景—檢測(cè)器,種類：紫外檢測(cè)器(UV) 熒光檢測(cè)器(FD)  電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)  蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD) 示差折光檢測(cè)器(RID),紫外檢測(cè)器(UV),原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)

15、度與組分濃度成正比。優(yōu)點(diǎn):a: 靈敏度高，檢測(cè)下限約為 10-6 g／ml b: 線性范圍廣 C: 對(duì)溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫紫外檢測(cè)器的類型:　①固定波長(zhǎng)型(已淘汰)；?、诳勺儾ㄩL(zhǎng)型(最常用)；?、鄱O管陣列檢測(cè)器(最新型)。,二極管陣列檢測(cè)器（DAD）,時(shí)間、光強(qiáng)度和 波長(zhǎng)的三維譜圖,熒光檢測(cè)器（FLD）,原理: 物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能 級(jí)，這些電子從高能級(jí) 躍至低能級(jí)

16、時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光 波長(zhǎng)較 長(zhǎng)的光，這種光稱為熒光。 熒光強(qiáng)度(F)與激發(fā)光強(qiáng)度(I0)及熒光物質(zhì)濃度(C)成正比。 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高、選擇性好，是微量組分和體內(nèi)藥物分析常用的檢測(cè)器之一。,熒光檢測(cè)器（FLD）結(jié)構(gòu)示意圖,HPLC-FLD檢測(cè)發(fā)霉的花生中的黃曲霉素B1和黃曲霉素B2,黃曲霉素B2,黃曲霉素B1,流動(dòng)相：H2O :乙腈：甲醇 (60/20/20, v/v/v)流速：1mL/min柱溫：25℃,電化學(xué)檢測(cè)

17、器(ECD),原理（電導(dǎo)檢測(cè)器）：兩個(gè)對(duì)電極測(cè)量樣品中離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)，由電導(dǎo)的變化測(cè)定的濃度。原理（安培檢測(cè)器）：利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表明發(fā)生氧化還原反應(yīng)，兩電極間有電流通過，電流大小與待測(cè)物質(zhì)濃度成正比。適用范圍： 凡具氧化還原活性的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測(cè)，本身沒有氧化還原活性的物質(zhì)經(jīng)過衍生化后也能進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度很高，尤其適用于痕量組分分析。,HPLC-ECD檢測(cè)綠原酸、咖啡酸、阿魏酸,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(E

18、LSD),原理： 將洗脫液引入霧化器與氣體混合形成均勻的微小液滴，蒸發(fā)除去流動(dòng)相而樣品組分形成氣溶膠，進(jìn)入檢測(cè)室，用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測(cè)散射光。散射光的強(qiáng)度(I)與組分的質(zhì)量(m)通常具有下述關(guān)系：I＝Kmb,散射光的對(duì)數(shù)響應(yīng)值與組分質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。,HPLC-ELSD測(cè)定磷酸陰離子 鈣陽離子,4. HPLC發(fā)展前景—聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）,,液質(zhì)(L

19、C/MS)聯(lián)用系統(tǒng)的示意圖,HPLC-MS優(yōu)點(diǎn)：,1.是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極 性大、分子量大的物質(zhì)的電離。2.主要生成準(zhǔn)分子離子（[M+H]+ 、[M- H]-、 [M+Na]+等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。3.靈敏度高4.不能進(jìn)行譜庫(kù)檢索5.不適用于非極性化合物的分析,HPLC-MS應(yīng)用,LC/MS檢測(cè):利血平,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）,HPLC-MS/MS: 第一級(jí)質(zhì)譜分

20、離感興趣的離子，第二級(jí)質(zhì)譜通過在碰撞過程中產(chǎn)生的碎片譜來表示其特征。與HPLC-MS比較： HPLC-MS/MS技術(shù)可減少或消除樣品基質(zhì)中無關(guān)物的干擾，特異性好，靈敏度高，分析速度快，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，為物證鑒定提供絕對(duì)可靠的依據(jù)，如毒物分析、濫用藥物鑒定、爆炸殘留物分析等.,高效液相色譜-共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)（HPLC-RRS）,聯(lián)用裝置圖,HPLC-RRS優(yōu)點(diǎn),分離效率高分析數(shù)度快選擇性好自動(dòng)化檢測(cè)為無電化學(xué)性質(zhì)和光

21、譜性質(zhì)的物質(zhì)提供新的檢測(cè)手段可直接用于復(fù)雜樣品中微量組分的分離及測(cè)定。,HPLC-RRS的應(yīng)用,HPLC-RRS技術(shù)和HPLC-UV檢測(cè)土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素圖譜,HPLC-RRS測(cè)定血樣中氨基糖苷類抗生素,4. HPLC發(fā)展前景—聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-核磁共振波譜聯(lián)用（HPLC-NRM）優(yōu)點(diǎn)： 1.分離和結(jié)構(gòu)解析 2.對(duì)光、氧不敏感缺點(diǎn)： 1