hplc使用須知

1、HPLC 使用須知,劉揚中 實驗室2009.09.12,內容簡要,I HPLC儀器簡介II HPLC 的使用及注意事項Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護IV 錯誤實例,,高效液相色譜 (High performance Liquid Chromatography) -----儀器簡介,,易學難用,,,,UV檢測設備,,,色譜柱,,進樣閥,HPLC儀器簡介,,,,HPLC儀器簡介,BCAD,,HPLC儀器簡介,,Agi

2、lent 1100 手動進樣器工作原理,HPLC儀器簡介,,,Ⅱ HPLC 使用及注意事項,樣品的準備流動相的準備開機前的準備進樣前的準備實驗步驟實驗結束,基本原則： 避免由人為因素引起的系統(tǒng)或柱子損傷,源頭： 樣品流動相儀器操作,實驗目的：樣品經過色譜柱達到分離分析的目的,一、 樣品的準備,溶解樣品的溶劑選擇,與流動相 相溶 有機流動相： 盡量避免NaCl、磷酸緩沖鹽，

3、TEAA較好。如果不確定，可以先實驗溶劑與流動相的相溶性。在固定相上可保留（針對進樣體積較大時）離子交換柱：不用高鹽溶劑反相柱：不用純有機溶劑適當?shù)膒H 值,最好使用流動相溶解樣品,一、 樣品的準備,樣品溶液除雜質,離心沉淀懸浮物（可能看不見） 10min 12K （注意：離心管會發(fā)熱) 。如果有沉淀，將上清液轉移到新的離心管中過濾（針對進樣體積較大時）水溶液：0.22 ?

4、m 濾膜過濾 （1、5、10ml注射器） 4°久置的多肽和DNA樣品；分離制備樣品使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。,二、 流動相的準備,流動相選擇,液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：,對樣品具有一定的溶解能力，樣品組分不會沉淀在柱中流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應 流動相的黏度要盡量小流動相的物化性質要

5、與使用的檢測器相適應流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡在流動相配制好后，一定要進行脫氣,流動相流速的選擇：,內徑 4.0mm，0.8ml/min內徑 4.6mm， 1ml/min內徑 10.0mm，5ml/min (半制備),二、 流動相的準備,流動相選擇,使用高純度試劑（色譜級溶劑、高純水、鹽）反相柱，如C18柱（易吸附 極性小的物質）流動相：高極性?低極性 如：A= H2O, B=CH3OH or CH3CN

6、梯度應用： 90% A 10%B ? 100% B,反相柱--注意： 除非有說明，反相柱不能使用100% 水，否則會損壞固定相 !!若A相含鹽（NaCl, NaClO4）或為緩沖液(磷酸、醋酸)（>10mM），B為有機相，則應開通C或D通道，為純水以緩沖A B通道的直接接觸,二、 流動相的準備,流動相選擇,分離的樣品在A、B中均可溶 !!!例如：沉淀的發(fā)生 DNA + TFACu2+、Ni2+ + 磷

7、酸緩沖鹽跨膜肽段 + 水分離效果 （參照文獻，他人實驗，自主摸索）,強陰離子SAX交換柱（易陰離子物質）流動相：低濃度鹽?高濃度鹽 （NaCl or 磷酸緩沖鹽）如：A= 50mM NaCl, buffer , B= 2 M NaCl梯度應用： 100% A ? 100% B,強陰離子交換柱--注意：防止流動相，通道，柱子生長細菌，流動相應加 0.1-1 mM NaN3，操作時戴手套,二、 流動相的準備

8、,流動相選擇,更換流動相之前，必須事先閱讀色譜柱的說明書 !!（每根色譜柱均有獨立的說明書和出廠報告：使用注意事項，恢復柱效，出廠壓力等）注意色譜柱對流動相的要求 （pH值、有機溶劑）可用pH 值SAX柱 PN:880952-703： 2.0 ~ 7.0C18柱: Agilent Zorbax SB-C18, 880975-902: 1.0 ~ 8.0Eclipse XDB-C18: 2.0 ~ 9.0Kro

9、masil C18, PC-1025: 2.0~8.0,二、 流動相的準備,流動相處理,0.22 ?m 濾膜過濾，除去懸浮顆粒所有含鹽、或含水溶劑，必須膜過濾 !!100% 色譜純有機試劑，最好過濾后使用 水膜(纖維素酯膜)：只含水和鹽，不含任何有機相 有機膜：有機相，有機相和水的混合相 有機相能溶解纖維素酯膜剛剛從純水儀接的水，可以不過濾直接使用過夜溶劑（保存

10、在4℃），重新過濾后可以使用適當?shù)睦?：新近過濾的 100% 色譜純有機試劑流動相現(xiàn)配現(xiàn)用，剩余的流動相(水相)及時清理，試驗間隔>2天，建議倒掉任何溶劑，如果有可見懸浮物、菌絲，不可使用 !!,二、 流動相的準備,流動相處理,除氣，可提高分離效果（峰型）、延長儀器壽命。除氣不好時，可能使再現(xiàn)性降低，甚至無法分離。在舊儀器上常見。脫氣機的處理速度非常有限，無法除去大量氣體（如氣泡）過濾后，使用前

11、，超聲儀超聲10-15 min,磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細菌和霉菌的影響，不得放置過夜，應臨用現(xiàn)制。 注意：用緩沖液后不能直接換用有機溶劑(實驗過程),三、開機前的準備,流動相檢查,泵的入口：有機溶劑在上(B,C 通道)，水相在下(A,D 通道)（避免鹽沉淀）溶劑體積檢查 – 與程序中體積一致。除去管路內的氣泡。每次取出、放回 玻璃過濾頭均需要檢查!!清理廢液瓶,2. 計算機 IP 地址的檢查,3. 關閉脫機程序,

12、四、開機,開機注意事項,先開HPLC儀器開關，脫氣機，泵和紫外檢測電源等各電源開啟后(30s), 打開在線軟件在線程序上，先開啟泵，暫不開紫外燈。走平衡時，打開紫外燈設置梯度和波長，或引用方法(注意檢測的紫外波長)設置文件保存路徑,具體的操作事項見HPLC開機操作步驟,四、開機,排氣,-- 除去管路內可能殘留的氣泡,旋開Purge閥 ，流速從1 ml/min升至到5 ml/min，壓力應該< 10 bar如果

13、壓力明顯大于10 bar，可能是過濾白頭堵塞，需要更換、或清洗。過濾白頭通?？梢允褂?-6個月，如果過快，可能是流動相不清潔。檢查過濾過程的錯誤。逐個處理每個需要使用的流動相 3 ~ 5 min，5 ml/min注意：管路中如果看到氣泡，不可使用泵排氣!!! 必須事先手工排出氣泡。,,,進樣,平衡壓力,洗柱壓力,最大壓力,五、實驗步驟,注意壓力的變化,五、實驗步驟,樣品分析,平衡柱子 10-15min,反相:90% A水相

14、,10% B有機相陰離子交換:100% A 低鹽相,進樣針進樣,扳下定量環(huán)進入設好的梯度程序(20-30 min)清洗柱子10 -15min(100% B),………………………,平衡柱子 10-15min………..,注意壓力的變化,五、實驗步驟,數(shù)據分析,打開脫機程序,找到相應文件雙擊打開,查看保留時間,峰高,峰面積 等簡單的數(shù)據處理----截屏導出數(shù)據,文本形式,origin 作圖,六、實驗結束,清洗色譜柱、定

15、量環(huán) 、進樣針,C18 反相柱應保存于純有機溶劑中，不含任何 酸、鹽！洗凈殘余的酸(TFA)、緩沖鹽 （用90% 純水、10%有機溶劑，5柱體積）除去水（用100% 有機溶劑，如甲醇 5柱體積）離子交換柱旋開purge 閥,純水清洗通道(A,D) 5ml/min 清洗5min.純水洗去柱子的鹽溶液, 5柱體積的水5柱體積純有機相保存柱子,建議乙腈.,用數(shù)倍體積的甲醇沖洗定量環(huán)和進樣針（或結合在下面步驟中）,進樣

16、針保存好,如果當天實驗結束較晚、且次日早晨繼續(xù)實驗，清洗步驟可適當從簡。(必須確保酸、鹽不過夜),六、實驗結束,更換流動相,旋松Purge閥，流動相不經過色譜柱將四個過濾頭均存放于有機溶劑瓶中，以防長菌先用純水將含緩沖鹽的管路洗凈再用甲醇/乙腈將水排出, 充滿柱子,如果當天實驗結束較晚、且次日早晨繼續(xù)實驗，在確保安全的條件下（無腐蝕、不會長菌） ，此步驟可不做。,關閉程序和儀器電源,先把流速調為0, 壓力將為0或1bar,再關閉

17、軟件程序(泵和紫外).依次關閉脫氣機,泵和紫外檢測器的電源,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,一 色譜柱二 進樣閥三 通道和脫氣機四 泵五 紫外檢測設備六 其它,,,Eclipse XDB-C18, 5u, 4.6*150mmZorbax SB-C18 5u, 4.6*250mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mm,一

18、 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,實驗室色譜柱統(tǒng)計：,Agilent 公司,PN:993967-902SN:USKH031706LN:B07016,,PN:880975-902SN:USCL024985LN:B07051,,PN:880952-703SN:USA0006475LN:ZBX0759005,,PN:880952-703SN:USKH031706LN:B07016,,,Phenomenex公司,Kroma

19、sil 5u C18 10*250mm (半制備) 貨號：PC-1025 柱號：809110Kromasil 5u C18 4.6*250mm 貨號：PC-1025 柱號：06L25536 柱號： 90318,,1、色譜柱的使用說明 √儲存液, PH值適用范圍2、色譜柱的保存 3、色譜柱的再生

20、 √色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加,柱效下降4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 ,柱壓升高等,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,使用說明書和出廠報告:,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,故障癥狀,A. 色譜柱柱壓,B. 色譜峰峰形,,C. 保留時間,,峰形問題多 是復合型問題,保留，色譜柱和分析結束時間都發(fā)生改變,解決辦法詳見:色譜柱維護,（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染； 解決方法

21、：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。 （2）色譜柱頭的填料被樣品污染； 解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲。 （Ⅲ）色譜柱內緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶

22、析出；解決方法：如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。 （4）流動相PH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。解決方法：如果因PH值使用不當，很難恢復 。,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,柱壓升高部分常見原因及解決辦法：,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動,,更換色譜柱時，配件的使用,預柱,,,,預柱套 預柱芯,,,預柱,,Agilent 都有預柱，柱套 不變，更換柱

23、芯，注意方向,預柱,,1. 為了防止虹吸應注意使第五第六號放空管的出口與進樣口保持在同一平面.2. 為了更好的重現(xiàn)性，進樣體積最好是樣品環(huán)的5-6倍。3. 一定要使用合規(guī)格的進樣器，規(guī)格為外徑0.028英寸，長2英寸的平頭針。一定不能使用尖針！它會嚴重刮壞轉子墊圈。4.轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在進樣閥的中間位置5.常用密封墊的材質適用pH<10,樣品溶液pH小于10； 否則換特氟隆材質的密封墊pH10-136..

24、進完樣后一定要及時沖洗進樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動相由于這些溶液會形成結晶從而磨損墊圈。沖洗方法：A. 將進樣器轉至Inject位置，利用液相泵輸送高純水沖洗(這時是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.B.用閥清洗接頭和注射器沖5. 經常用濕潤的軟布清潔進樣器，特別是進樣口周圍,二 進樣閥,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,注意事項:,二 進樣閥,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,通常結合兩方面：1 從進樣器觀察，進樣后將針拔出，若從進樣口或排空

25、管有液體冒出，顯示密封圈磨損。2 從結果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時間不穩(wěn)定和殘留嚴重。,如何判斷手動進樣器的密封圈漏？,a) 扳到load的位置，進樣時選擇勻速慢推，進樣量要大于定量環(huán)的兩倍以上。 如果要進樣量小于定量環(huán)，最好，進樣體積小于定量環(huán)的一半。b) 進樣后，迅速的將扳手扳到inject位置，2-3min 后把進樣針取出，不要把針長時間留在進樣器上，因為針在上面，針筒很重，針尖會受到比較大的力，針尖容易變形，時間

26、長了，就會變形，也會影響進樣的準確性。c)進樣針，每次用了都要及時用溶劑清洗。避免溶液殘留，堵塞塞針。最后要用甲醇清洗，以防生銹。d)手動進樣器在扳動的時候，手旋轉的時候，要尋找轉動的軸心和進樣的圓形一直，否則費力，而且容易把手動進樣扳壞。,如何準確進樣,三 通道和脫氣機,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,溶劑過濾器堵塞或長菌1:1 HNO3 (35%) 浸泡1小時，超純水洗凈,建議不使用超聲波清洗機清洗,定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，

27、每三個月至少清洗一次管路長菌的現(xiàn)象－擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶　劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。－查看過濾器是否變色．管道和瓶中是否有細微狀物－臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常原因：雖然將玻璃濾頭放置在甲醇中，管路中仍然是含水溶液處理：旋開purge閥50℃水沖洗管道30min, 100% 異丙醇低速(0.5-0.8ml/min)沖洗管路數(shù)小時,甲醇

28、或乙腈沖洗管路,,污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵的運行。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。下列建議將會延長溶劑過濾器的使用壽命并維持泵的運行。使用滅過菌的溶劑瓶來減緩藻類生長。使用新鮮配制的流動相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過兩天。如果應用許可，在溶劑中加入0.0001－0.001 M的疊氮化鈉。避免溶劑瓶暴露在直射陽光下。用氬氣置換流動相上層的空氣,三 通道和

29、脫氣機,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,防止堵塞溶劑過濾器,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,三 通道和脫氣機,2)將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)。,四 泵,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,如何更好地使用四元泵,,1),操作泵之前，用至少兩個體積（標準脫氣機30ml，對微脫氣機10ml）沖洗真空脫氣機,特別是當泵關閉了一段時間后（例如，過夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。,3),四 泵,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,五

30、 紫外設備,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,燈：紫外區(qū)域采用有通光狹縫的氘燈作光源， 低壓氘氣體的等離子體能發(fā)出190nm到大約800 nm的光?？梢姽猓╒IS）和近紅外光采用低噪音鎢燈得到， 其發(fā)射出的光譜范圍為470---950 nm,五 紫外設備,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,注意事項:,紫外燈不要頻繁開啟,燈關閉,2h 之后才可以再開. 有些過程不需要開紫外燈,如:更換色譜柱,脫氣,實驗結束時流動相保存柱子的過程等.,紫外

31、燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時打開檢測器，20分鐘后可以進行檢測；在分析完閉后，先關紫外燈。（頻繁的開關燈會縮短燈的使用壽命）樣品池要常清洗,日常操作條件,最好是恒溫、恒濕 溫度：15-30℃ 相對濕度<80% 房間應有良好的通風 空調或其他設備產生的氣流不要直吹儀器 避免光線直射 遠離高電干擾、高振動設備,六 其它,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,六 其它,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護,,及時清理臺面、定

32、期擦拭儀器,清理灰塵 剩余的含水流動相及時處理,不要長時間放置流動相的廢液分類處置,環(huán)境清潔,實驗記錄,實驗過程中時刻注意壓力等試驗參數(shù)的變化,并做好實驗記錄熟悉/記錄每個色譜柱(1ml/min)在不同流動相不同梯度下的壓力,防止出現(xiàn)異常而不知的情況.需要記錄的壓力包括:洗柱壓力,平衡壓力,試驗梯度中的最大壓力.如果壓力明顯過高，檢查原因(任何堵塞）;壓力突然降低 – 檢查漏液。,,,,,實驗室電子記錄,六 其它,Ⅲ HPLC

33、 的保養(yǎng)與維護,,進樣,平衡壓力,洗柱壓力,最大壓力,,,,,壓力異常,IV 錯誤實例,,錯誤實例,現(xiàn)象：5ml/L 時壓力>10bar,或換過濾白頭后很快又堵塞原因：過濾時濾膜使用錯誤水溶液 – 水性濾膜 （?）有機溶劑 – 有機膜 （?）混合溶劑 – 有機膜 （?）水溶液 – 有機濾膜 （? ）混合溶劑 – 水性膜（ ? 膜被溶解）處理：更換過濾白頭，見更換視頻。 換掉的過濾白頭進一步

34、清洗，超聲等。,過濾白頭堵塞,管路長菌,現(xiàn)象：原因：處理：,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護三 通道和脫氣機,見ppt,,錯誤實例,排氣不干凈,現(xiàn)象：排氣時出液管中總是有氣泡原因：更換溶劑瓶時大量空氣進入、沒有手工排氣結果：可能需要連續(xù)排氣1 - 2小時如果空氣進入柱子非常可能損壞色譜柱處理：溶劑先超聲10-15min。若系統(tǒng)引入大量空氣需要異丙醇脫氣，不經過柱子。,IV 錯誤實例,,系統(tǒng)漏液,現(xiàn)象：儀器會自動檢測到液體而

35、自動停止試驗原因：接口漏液，泵漏液，紫外等處漏液處理：停止試驗，找出漏液端，進一步分析原因，采取相應措施，更換器件或維修,錯誤實例,泵的柱塞桿密封圈磨損,現(xiàn)象：泵端漏液，下方有積液，泵自動關閉原因：密封圈磨損后，導致有間隙存在。流動有顆粒存在或析出鹽都會加速其磨損處理：更換密封墊。,IV 錯誤實例,,錯誤實例,色譜柱堵塞,現(xiàn)象：壓力偏高,比正常情況下高幾十bar處理：確定是色譜柱還是系統(tǒng)堵塞:斷開系統(tǒng)與柱子的接口,1ml/m

36、in 流速, 壓力在10bar 左右,說明不是系統(tǒng)引起;若壓力明顯很高,有可能是系統(tǒng)某部位堵塞.確定是色譜柱還是預柱堵塞,斷開預柱與柱子的接口,1ml/min 流速, 壓力在30bar 左右,說明不是預柱引起;若壓力明顯很高,很可能是預柱堵塞.確定是色譜柱堵塞,分析是什么原因引起.,IV 錯誤實例,,錯誤實例,錯誤現(xiàn)象分析的一般流程,IV 錯誤實例,,異常現(xiàn)象,,分析原因,詢問實驗室人員咨詢Agilent客服網上查詢,,,維修處

37、理,,運行驗證,,繼續(xù)試驗,停止,試驗,請 閱讀 使用手冊 !!,如有不確定的問題，請及時咨詢:（公司、手冊、Agilent網站、他人、經驗交流網站 ）,如有不確定的問題，請及時咨詢:（公司、手冊、Agilent網站、他人、經驗交流網站 ）,常用網站,Agilent客服電話: 8008203278,Agilent Technologies: http://www.chem.agilent.com/en-US/Pages/Homepa