2015版中國藥典

1、2015年版《中國藥典》微生物限度檢查法計(jì)數(shù)法修訂解析,一、修訂背景,1、國際化（1）美國、歐盟、日本制藥產(chǎn)品占世界市場份額的70-80%；ICHQ4B(藥品管理部門對藥典的互認(rèn))附錄4A、4B和4C已經(jīng)得出結(jié)論，美國藥典、歐盟藥典、日本藥典中的微生物限度檢驗(yàn)方法協(xié)調(diào)統(tǒng)一。（2）中國雖然不是ICH的成員國，但中國與國外制藥行業(yè)交往日益增多，且中國藥品要想進(jìn)入國際市場，藥品檢驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一勢在必行。,一、修訂背景,2、方法科學(xué)性和

2、靈活性（1）準(zhǔn)確度：方法適用性試驗(yàn)?zāi)M樣品污染微生物后進(jìn)行方法試驗(yàn)性驗(yàn)證。（2）精密度：結(jié)果判定以變化范圍進(jìn)行規(guī)定，符合微生物計(jì)數(shù)規(guī)律。（3）培養(yǎng)體系：采用更適宜的培養(yǎng)體系。（4）偏差調(diào)查：微生物檢驗(yàn)結(jié)果偏差調(diào)查的引入。（5）與微生物指導(dǎo)原則、理念有機(jī)統(tǒng)一。,一、修訂背景,3、兼顧國情：（1）適用性試驗(yàn)增加供試品對照組（2）菌種采用CMCC（3）檢驗(yàn)量、樣品制備依照《中國藥典》2010年版，與ICH不同。主要工藝、劑型限

3、制，例如貼劑檢驗(yàn)量規(guī)定完全不同。,一、修訂背景,4、依據(jù)以上原則修訂后具有以下特點(diǎn)：（1）修訂后的計(jì)數(shù)法明確了《中國藥典》2010年版未規(guī)定的事項(xiàng)。如：該檢查方法的適用范圍，替代法的應(yīng)用原則。（2）修訂后的計(jì)數(shù)法合理性、有效性、準(zhǔn)確性得以充分體現(xiàn)，結(jié)果更接近真實(shí)污染狀況。如：方法適用性加菌方式發(fā)生變化。（3）修訂后的計(jì)數(shù)法與美國、歐洲、日本藥典協(xié)調(diào)后方法一致，對于采用國際、國內(nèi)兩套體系（檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)）的生產(chǎn)企業(yè)而言，在方法一

4、致的前提下，檢測結(jié)果具有可比性，減輕企業(yè)檢驗(yàn)負(fù)擔(dān)。,二、格式變化,一個(gè)部分微生物限度檢查法三個(gè)部分1、非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法2、非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法3、藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)部分合并一部和二部內(nèi)容,修訂前,修訂后,三、通用要求,1、檢測環(huán)境（1）環(huán)境潔凈度應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。（2）現(xiàn)狀：2010年版GMP環(huán)境分級以A、B、C、D定義，對于微生物檢測環(huán)

5、境無具體描述，與國家標(biāo)準(zhǔn)分級不一致；相應(yīng)的監(jiān)測方法有區(qū)別。制藥企業(yè)難以制定對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。（3）國際協(xié)調(diào)案要求：在適宜的潔凈度的環(huán)境中進(jìn)行。（4）發(fā)展趨勢：既要最大可能防止微生物污染，又要防止檢驗(yàn)過程對環(huán)境和人員造成的危害?；顒?dòng)區(qū)域的合理規(guī)劃及區(qū)分將提高微生物實(shí)驗(yàn)室操作的可靠性。,三、通用要求,1、檢測環(huán)境（5）USP實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則： 1）實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃分合理：無菌、非無菌樣品操作區(qū)域應(yīng)與活菌培養(yǎng)區(qū)完全隔離，或采取其他無菌操

6、作及防護(hù)措施減少污染事件發(fā)生概率。所有在實(shí)驗(yàn)室操作的關(guān)鍵檢測過程在控制條件下執(zhí)行。 2）無菌檢查的較適宜環(huán)境：隔離器的使用。,三、通用要求,2、供試品前處理,供試品,需前處理,不需前處理,有抑菌作用,無抑菌作用,去除抑菌作用,檢查,,,,,,,,,,,,,,,,①方法適用性試驗(yàn)前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。,,中和劑滅活劑,②可以通過方法適用性試驗(yàn)判斷,③驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及方法對污染菌生長、檢出的影響,三、通

7、用要求,3、微生物計(jì)數(shù)法適用范圍,（1）微生物計(jì)數(shù)法適用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。（2）明確規(guī)定本法不適用于活菌制劑的檢查。（3）明確規(guī)定本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動(dòng)檢測方法，但必須 證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。,三、通用要求,4、微生物計(jì)數(shù)定義變化,三、通用要求,5、計(jì)數(shù)方法（1）平皿法：包括傾注法和涂布法。該項(xiàng)下明確可使用直徑較大平皿，且培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。（2）薄

8、膜過濾法（3）最大可能數(shù)（Most-Probable-Number Method,簡稱MPN）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法時(shí)使用，不適用于霉菌計(jì)數(shù)。（4）方法選擇原則：根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇。,三、通用要求,6、菌種（1）原則 不同來源菌種在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)依據(jù)《中國藥典》2010年版附錄Ⅹ Ⅷ G藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則的要求，藥品微生物檢驗(yàn)

9、用試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。,三、通用要求,（2）菌種編號CMCC——中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心 CMCC(F) 或 CMCC(B) B——代表細(xì)菌 F——代表真菌ATCC——美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心 著名的微生物保藏中心，創(chuàng)立于1899年，設(shè)在美國馬里蘭州羅克維爾市。收藏有細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物病毒、噬菌體、藻類和原生

10、生物等16000株以上的微生物種株。,三、通用要求,（3）傳代： 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）。 代的定義：每接種一次即為一代（有在新鮮的培養(yǎng)基上生長過程）,,,,,,,,,,,,,,,CV1,CV2,CV3,QC,干燥菌種（0代）,液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代）,三、通用要求,（4）菌種的保藏1）冷凍：在低溫下保藏，需要加入保護(hù)劑，例如甘油，可以減少

11、冷凍對菌種的傷害，一般在低于-30℃或-70 ℃冰箱內(nèi)保藏，是一種有效的長期儲藏方法。2）凍干法保藏：是一種長期保藏菌種的方法，一般情況下購買的凍干菌種即為此種方法。使用時(shí)需要進(jìn)行溶解、復(fù)壯、冷藏。3）冷藏：在2～8 ℃的冰箱保藏，是一種短期的有效的短期儲藏方法。儲藏方法符合藥典要求。,三、通用要求,（5）菌種及菌液的制備 各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身操作習(xí)慣總結(jié)出一套切實(shí)可行、快速穩(wěn)定的菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序。注意事項(xiàng)：1

12、）使用前確認(rèn)菌種身份2）根據(jù)生產(chǎn)商說明書復(fù)蘇菌種3）使用接種技術(shù)，不要重復(fù)從菌種包裝瓶中移取菌種或重新冷凍菌種。4）傳代代數(shù)（每接種一次即為一代）5）菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8 ℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。,三、通用要求,7、試驗(yàn)菌,大腸埃希菌,銅綠假單胞菌,三、通用要求,8、培養(yǎng)基,三、通用要求,9、培養(yǎng)條件嗜熱型微生物最適生長溫度為45℃～58 ℃嗜溫型為25℃～43 ℃嗜冷型為10℃～18

13、 ℃金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37 ℃，白色念珠菌和黑曲霉最適生長溫度為28 ℃，均為嗜溫型微生物。,四、培養(yǎng)基適用性檢查,四、培養(yǎng)基適用性檢查,四、培養(yǎng)基適用性檢查,四、培養(yǎng)基適用性檢查,四、培養(yǎng)基適用性檢查,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),1、供試品,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),2、稀釋液,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3.試驗(yàn)菌,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),4、方法,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),常見的中和劑或滅活方法,五、計(jì)

14、數(shù)方法適用性試驗(yàn),無抑菌性樣品方法適用性-例：多潘立酮片1、方法適用性試驗(yàn)前評估（1）根據(jù)處方進(jìn)行分析，產(chǎn)品中是否有抑菌成分；（2）參照歷史上曾經(jīng)進(jìn)行過的方法驗(yàn)證，根據(jù)歷史數(shù)據(jù)判斷產(chǎn)品是否有抑菌性；（3）也可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷樣品中是否有無抑菌性。通過以上判斷，起草方法適用性試驗(yàn)草案，確定方法適用性試驗(yàn)具體過程。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),無抑菌性樣品方法適用性-例：多潘立酮片2、通過以上評估，判斷多潘立酮片無抑菌性，可以采用規(guī)

15、定的稀釋液制備方法，采用平皿（直徑90mm）法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，具體如下：（1）樣品制備：稱取供試品10g，加至TSB中，制成1:10的供試液；（2）試驗(yàn)組：西區(qū)1：10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液后搖勻；（3）菌液對照組：西區(qū)胰酪大豆胨肉湯9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的試驗(yàn)菌懸液后搖勻；,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),無抑菌性樣品方法適用性-例：多潘立酮片（4）試驗(yàn)組和菌液對照組搖勻后，分別從試

16、驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每種試驗(yàn)菌平行2份。（5）供試品對照組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行4皿，其中兩個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另兩個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。（6）將以上平皿分別30～35℃或20～25℃培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)不超過3天，真菌培養(yǎng)不超過5天，在3天和5天分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),無抑菌性樣品方法適

17、用性-例：多潘立酮片（7）結(jié)果計(jì)算：判斷試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組的比值是否在0.5～2范圍內(nèi)。如果是，則方法適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。（8）建議：生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)以上方法第二人及第三人進(jìn)行確認(rèn)。如果均滿足要求，則該方法適用性試驗(yàn)通過，可以用于日常檢驗(yàn)。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（1）需氧菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（2）霉菌和酵母菌總數(shù),五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用

18、性-例：曲安奈德益康唑乳膏1、方法適用性試驗(yàn)評估：（1）處方及歷史數(shù)據(jù)分析：益康唑?qū)γ咕?、酵母和部分陽性桿菌均具有抑菌性。（2）根據(jù)歷史數(shù)據(jù)分析，曲安奈德益康唑乳膏對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、霉菌均有一定的抑菌性，需要進(jìn)行稀釋，加入中和劑對抑菌性中和后進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。（3）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)：需氧菌總數(shù)不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)不大于101cfu/g。注意：如果采用稀釋法，需氧菌總數(shù)的稀釋度不大于1:100，霉菌

19、和酵母菌總數(shù)的稀釋度不大于1:10，否則有一個(gè)菌落生長，樣品則不能滿足限度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：曲安奈德益康唑乳膏2、根據(jù)以上判斷，初步設(shè)定的方法適用性試驗(yàn)如下：（1）樣品制備：稱取供試品10g加入含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯中，制成1:10的供試品溶液；吸取1:10的供試液20ml加入80ml含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯中，搖勻制成1:50供試液。（2）試驗(yàn)組：

20、 ①吸取1:50的供試液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌懸液后搖勻，確認(rèn)需氧菌總數(shù)測定方法。 ②另吸取1:10的供試液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液后搖勻，確認(rèn)霉菌和酵母菌總數(shù)的測定方法。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：曲安奈德益康唑乳膏（3）中和劑對照組：吸取含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。（4）菌液對照組：

21、吸取胰酪大豆胨肉湯9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。（5）供試品對照組：吸取1:50的供試液10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，平行制備兩份，加入TSA培養(yǎng)基；吸取1:10的供試液10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，平行制備2份，加入SDA培養(yǎng)基，搖勻。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：曲安奈德益康唑乳膏（6）試驗(yàn)組、中和劑對照組和菌液對照組搖勻后，分別從TAMC試驗(yàn)菌試管中吸取10ml加入直徑

22、14cm的3個(gè)平皿中，加入TSA培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，加入SDA培養(yǎng)基。（7）將以上平皿放入30～35℃或20～25℃培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)不超過3天，真菌培養(yǎng)不超過5天，在3天和5天分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。（8）結(jié)果計(jì)算： ①判斷試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組的比值是否在0.5～2范圍內(nèi)。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：曲安奈德益康唑乳膏 ②中和劑對照組的

23、菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。 ③如果以上均滿足要求，則適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。（9）建議：生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)以上方法第二人及第三人進(jìn)行確認(rèn)。如果均滿足要求，則該方法驗(yàn)證成功，可以用以日常檢驗(yàn)。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（1）需氧菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（2）霉菌和酵母菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑1、方法適用性試驗(yàn)評估：（1）處方

24、集歷史數(shù)據(jù)分析：該產(chǎn)品為抗真菌藥，對白色念珠菌具有抑菌性或殺菌性。（2）根據(jù)歷史數(shù)據(jù)分析，酮康唑洗劑對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌有一定的抑菌性，需要進(jìn)行稀釋，加入中和劑對抑菌性中和后進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。（3）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)不大于101cfu/g。注意：如果采用稀釋法，需氧菌總數(shù)的稀釋度不大于1:100，霉菌和酵母菌總數(shù)的稀釋度不大于1:10，否則有一個(gè)菌落生長，樣品則不能滿足限度

25、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑2、根據(jù)以上判斷，初步設(shè)定的方法適用性試驗(yàn)如下：（1）樣品制備：稱取供試品10g加入含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯中，制成1:10的供試液；吸取1:10的供試液20ml加入80ml含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯中，搖勻制成1:50供試液。（2）試驗(yàn)組： ①吸取1:50的供試液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌懸液后搖

26、勻，確認(rèn)需氧菌總數(shù)測定方法。 ②另吸取1:10的供試液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌懸液后搖勻，確認(rèn)霉菌和酵母菌總數(shù)測定方法。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑（3）中和劑對照組：吸取含有中和劑聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉湯9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。（4）菌液對照組：吸取胰酪大豆胨肉湯9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。（5）試驗(yàn)組、中和劑對

27、照組和菌液對照組搖勻后，分別從所有細(xì)菌試驗(yàn)菌試管中吸取10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種試驗(yàn)菌平行制備2份。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑（6）供試品對照組：吸取1:50的供試液10ml加入直徑14cm的3個(gè)平皿中，平行2份，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；吸取1:10的供試液10ml加入直

28、徑14cm的3個(gè)平皿中，平行2份，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。（7）將以上胰酪大豆瓊脂平皿放入30～35℃，沙氏葡萄糖瓊脂平皿放入20～25℃進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)不超過3天，真菌培養(yǎng)不超過5天，在3天和5天分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。（8）結(jié)果計(jì)算： ①判斷試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組的比值是否在0.5～2范圍內(nèi)。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑 ②中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌

29、落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。 ③如果以上均滿足要求，則適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（1）需氧菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),3、試驗(yàn)結(jié)果-（2）霉菌和酵母菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑4、小結(jié)：用中和劑以及稀釋法均不能使白色念珠菌和枯草芽孢桿菌恢復(fù)，進(jìn)一步用薄膜過濾法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)的優(yōu)化：（1）用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨

30、緩沖液10ml預(yù)濕濾膜；（2）取1:10的供試液10ml加入預(yù)濕后的濾膜中，立即過濾。（3）用含5%聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗200ml，100ml/次，在第二次沖洗液中加入50cfu試驗(yàn)菌，濾干后將濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑（2）中和劑對照組 ①用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml預(yù)濕濾膜。 ②取

31、10ml含聚山梨酯80的TSB加入預(yù)濕后的濾膜中，立即過濾。 ③用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗200ml，100ml/次，在第二次沖洗液中加入50cfu試驗(yàn)菌，濾干后將濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑（3）菌液對照組 ①用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml預(yù)濕濾膜。 ②用含5%聚山梨酯80的

32、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗200ml，100ml/次，在第二次沖洗液中加入50cfu試驗(yàn)菌，濾干后將濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑（4）供試品對照組 ①用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml預(yù)濕濾膜。 ②取1:10供試液10ml加入預(yù)濕后的濾膜中，立即過濾。 ③用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白

33、胨緩沖液沖洗200ml，100ml/次，濾干后將濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上。備注：培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間同平皿法，每一種試驗(yàn)用菌用一個(gè)濾膜。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),5、試驗(yàn)結(jié)果-（1）需氧菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),5、試驗(yàn)結(jié)果-（2）霉菌和酵母菌總數(shù)：,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),抑菌性樣品方法適用性-例：酮康唑洗劑根據(jù)以上的方法適用性試驗(yàn)，最終的檢驗(yàn)方法如下：(6)檢查方法：薄膜過濾法 ①供試液制備：稱取供

34、試品10g加入含有中和劑聚山梨酯80的TSB。 ②用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml預(yù)濕濾膜。 ③取1:10的供試液10ml加入預(yù)濕后的濾膜中，立即過濾，用含5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗200ml，100ml/次，貼于胰酪大豆胨瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上。 ④將以上胰酪大豆瓊脂平皿放入30～35℃培養(yǎng)3-5天，沙氏葡萄糖瓊脂平皿放入20～25℃培養(yǎng)5-7天。,五、計(jì)數(shù)方法

35、適用性試驗(yàn),5、MPN MPN法的最可能數(shù)法的精確性不及平皿法和薄膜過濾法，不適宜霉菌計(jì)數(shù)。因此該法僅在沒有其他方法可供選擇的情況下，作為需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)法。 例如：食品國標(biāo)中大腸菌群的MPN計(jì)數(shù)法（第一法），其優(yōu)點(diǎn)在于少量菌在經(jīng)過増菌后進(jìn)行直接觀察結(jié)果，通過查表得到計(jì)數(shù)結(jié)果。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),6、小結(jié)（1）抗菌活性的去除 ①增加稀釋劑和培養(yǎng)基的用量； ②加入中和劑或滅火劑； ③采用薄膜過濾

36、法和沖洗； ④綜合上述措施 若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么方法適用性試驗(yàn)中微生物禍?zhǔn)椎氖】煽醋鲆驗(yàn)楣┰嚻返目咕钚砸鸬?，同時(shí)表明該供試品不能（是否改成極難合適）被微生物污染。但是，供試品也可能僅對試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能是微生物生長的更高稀釋級的公事業(yè)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，

37、應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢測。,五、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),（2）影響因素 ①試驗(yàn)菌：革蘭陰性菌、格蘭陽性菌、霉菌和酵母菌； ②菌液的制備：菌液制備及儲存應(yīng)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化，滿足使用的菌液（群體）均一性，活性一致性； ③采特定的試驗(yàn)條件：包括緩沖液、溫度、水、光照應(yīng)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化且經(jīng)過驗(yàn)證； ④回收測定的關(guān)鍵因素：培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)條件方法適用性條件與樣品檢測條件需一致。,六、供試品檢查,1、檢驗(yàn)量,六、供試品

38、檢查,2、陰性對照,六、供試品檢查,3、計(jì)數(shù),六、供試品檢查,4、培養(yǎng),七、結(jié)果判定,1、計(jì)數(shù)要求,七、結(jié)果判定,2、計(jì)數(shù)干擾,七、結(jié)果判定,3、計(jì)數(shù)結(jié)果,七、結(jié)果判定,4、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（修訂后增加內(nèi)容）各品種項(xiàng)下要求執(zhí)行的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu 可接受的最大限度為20； 102cfu 可接受的最大限度為200； 103cfu 可接受的最大限度為2000；依此類推 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵

39、母菌總數(shù)的見擦結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。例如：檔標(biāo)準(zhǔn)為101cfu，不同于以往10cfu規(guī)定以10的指數(shù)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，考慮了微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的可變性，即計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度，而非類似化學(xué)檢驗(yàn)的結(jié)果。故要求我們需要在結(jié)果判斷時(shí)或制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，對于結(jié)果的判斷或歷史數(shù)據(jù)，工藝過程、用藥人群等進(jìn)行相應(yīng)分析，制定合理的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，即總原則為在內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的控制下產(chǎn)品無任何質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。

40、,七、結(jié)果判定,4、計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)理解）（1）該理論可參見《中國藥典》附錄及美國藥典結(jié)果精密度分析，從該部分內(nèi)容可以看出微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度與菌數(shù)的多少有直接關(guān)系，污染量偏小或偏大均有可能造成結(jié)果的誤差較大。同樣該部分內(nèi)容可以解釋培養(yǎng)基適用性檢查和方法適用性檢查的可接受限50～200%的含義。（2）當(dāng)平板上活細(xì)胞數(shù)量增加，聚集效應(yīng)導(dǎo)致計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性降低，較低評估了菌落數(shù)量。當(dāng)平板活細(xì)胞數(shù)量減少，隨機(jī)誤差導(dǎo)致較高評估菌落數(shù)量。（3）細(xì)

41、菌和包色念珠菌落計(jì)數(shù)范圍為25～250。此范圍對于藥典的微生物（特別是真菌）時(shí)可接受的。對于黑曲霉，每個(gè)平板最理想的計(jì)數(shù)方位是8～80之間。,八、增加新概念,1、MPN法適用范圍：含菌量較低的供試品細(xì)菌總數(shù)測定。可作為平板計(jì)數(shù)法和薄膜過濾法不適用時(shí)的補(bǔ)充。2、供試液制備中增加“分散均勻”概念，并非一定要溶解。3、表面活性劑使用時(shí)，在確認(rèn)對微生物無毒害性的同時(shí)，需要確認(rèn)與使用的中和劑或表面活性劑的相容性。4、偏差調(diào)查概念引入。,八、

42、增加新概念,偏差調(diào)查（1）當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)超?；虺瑯?biāo)時(shí)均需要進(jìn)行偏差調(diào)查。（2）調(diào)查范圍人、機(jī)、料、法、環(huán)。（3）偏差調(diào)查的范圍至少包括： ①微生物鑒別-初步確定污染源。 ②原始數(shù)據(jù)以及陰陽性對照回顧。 ③培養(yǎng)基及所用的其他耗材是否滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。 ④取樣環(huán)境是否滿足要求。 ⑤同期進(jìn)行檢驗(yàn)的其他結(jié)果是否正常。 ⑥消毒劑是否在有效期內(nèi)，且消毒是否正確。 ⑦必要情況下進(jìn)行相應(yīng)的復(fù)試。,,Thank You,